مطالعات بیوفیزیک سرطان با دقت تک‌سلول با استفاده از پلتفرم آزمایشگاه بر روی تراشه

تشخیص سرطان: چالش‌ها و راه‌های جدید
برخلاف پیشرفت‌های چشمگیر چند دهه‌ی اخیر، شاخه‌ی پژوهش‌های سرطان با مشکلات مهمی‌ روبه‌روست، این مشکلات ازجمله تشخیص و گسترش سرطان در بدن و ناهمگنی ذاتی بیماری، طراحی رویکردهای درمانیِ قابل‌اجرا را تا حد زیادی دشوار می‌‌کنند. تشخیص و طبقه‌بندی سرطان برپایه‌ی ویژگی‌های مورفولوژیکی و ژنتیکیِ بافت‌برداری بیمار انجام می‌‌شود، و این طبقه‌بندی نیازمند تجهیزات تخصصی و افراد آموزش دیده است.

اتوماسیون این فرآیند نه تنها باعث افزایش سرعت و دسترسی می‌‌شود، بلکه هزینه را به‌طور قابل‌توجهی کاهش می‌دهد. از بزرگ‌ترین مشکلات اتوماسیون می‌توان به فقدان عملکرد اختصاصی در مشخصه‌یابی برپایه‌ی بافت، هزینه‌ی بالا، ردپای آشکار پلتفرم‌های مشخصه‌یابی و کمبود نشانگرهای کمّیتی استاندارد برای سلول‌های سرطانی اشاره کرد. بنابراین، تلاش‌های پژوهشی اخیر با هدف بهبود رزولوشن (برای مثال سطح تک‌سلول در برابر سطح چندسلول)، کاهش هزینه و اندازه (برای مثال پلتفرم‌هایی برپایه‌ی میکروفلوئیدیک[1]) و جستجوی راه‌های جدید برای مشخصه‌یابی سلول‌ها و بافت‌های سرطانی برپایه‌ی ویژگی‌های فیزیکی آن‌ها (مانند نرخ تحرک و سختی) انجام می‌‌گیرد. این مقاله با تمرکز بر پلتفرم‌هایی که هم‌جهت با این معیار‌ها هستند، درنظر دارد تا پیشرفت‌های اخیر در زمینه‌ی پلتفرم‌های LOC که به منظور تشخیص و تعیین ویژگی‌های بیوفیزیکی سلول‌های سرطانی در سطح تک‌سلول به‌کار می‌‌روند را توضیح و همچنین نقاط ‌ضعف و فرصت‌های این شاخه را نشان دهد (شکل 1).

افزون‌بر آسیب‌شناسی بافت[2] و تشخیص بر اساس تصویربرداری داخلی، آزمایش مولکولی برای پیش‌آگاهی از سرطان و تعیین رژیم درمانی مناسب نیز در دهه‌های اخیر بسیار مورد توجه قرار گرفته‌است. آنالیز مولکولی از بافتِ تومور شامل جداسازی مولکول‌های سلولی نظیر DNA،  RNAو پروتئین از کل نمونه‌های بافت به‌منظور آزمایش و شناسایی ناهنجاری‌های آنکوژن می‌باشد. از تکنیک‌های مورد استفاده در این آنالیزها می‌‌توان به توالی کامل ژنوم، توالی RNA، توالی نسل بعد و واکنش زنجیره‌ای بلادرنگ[3] اشاره کرد. آنالیز مولکولی به‌طور چشمگیری قدرت تشخیص و کنترل سرطان با درمان‌های هدفمند را بهبود بخشیده اما چند اشکال عمده نیز دارد. اول، این تکنیک‌ها به تجهیزات پیشرفته، سیستم‌های کامپیوتری جهت کنترل حجم قابل‌توجهی داده و افرادی با مهارت بسیار بالا برای مدیریت و آنالیز این داده‌ها نیازمند است که هزینه‌ی بسیار سنگینی دربردارد. دوم، دقت این آنالیزها به تعداد سلول‌های سرطانی در نمونه‌ی بافت و تناوب ناهنجاری‌های اکوژن در این سلول‌ها بستگی دارد. اگر هریک از این دو کم باشد، خروجی قابل اعتماد نیست. برای غلبه بر این دو مشکل به سیستم‌هایی نیاز داریم که بتوانند آنالیز سلولی با هزینه‌ی کم و دقت بالا ارائه دهند.

تغییرات ژنتیکی سریع سلول‌های سرطانی و آنالیز تک‌سلول
یکی از مهم‌ترین چالش‌ها در پژوهش‌های سرطان، ماهیت پیچیده‌ی این بیماریست که اغلب نه به‌عنوان ‌یک بیماری، بلکه گروهی از چندین بیماری توصیف می‌‌شود. تغییرات ژنتیکی سریع سلول‌های درون توموری و میان‌توموری، ماهیت ذاتی سرطان است. بنابراین درمان می‌بایست ویژه‌ی هر بیمار و درطول دوره‌ی درمان بصورت منحصربفرد طراحی و درصورت نیاز تغییر کند. انحرافات ژنتیکی در سلول‌های عادی که منجر به تومورزایی (جهش‌های آنکوژن[4]) می‌‌شود، در هر بیمار متفاوت است. افزون‌براین، تکامل پیوسته و انباشتگی جهش‌های ثانویه در سلول‌های سرطانی که به پیشرفت و گسترش این بیماری کمک می‌کند، باعث همزیستی چندین جمعیت کلونال در تومور می‌‌شود. حتی بخش کوچکی از این سلول‌ها، که اغلب به عنوان سلول‌های اصلی سرطانی ‌یاد می‌‌شوند، قادر به احیای دوباره‌ی تومور پس از جراحی هستند. بنابراین تشخیص و هدف‌گیری توده‌های سلول به‌صورت مجزا امری ضروری است. تکنیک‌های سنتی تشخیص سرطان بر اساس جمعیت سلولی است که جزئیات ویژگی‌های هر سلول در اندازه‌گیری میانگین گم می‌‌شود. ازاین‌رو، پژوهش‌های سرطان به سمت پلتفرم‌های آنالیزی تک‌سلول با راندمان بالا در حرکت است. آنالیز تک‌سلول به ما اجازه‌ی تشخیص بهتر و درک دقیق‌تری از پیشرفت بیماری می‌دهد.

پیشرفت‌های چشمگیری در پلتفرم‌های آنالیز و ایزوله‌ی تک‌سلول برای سرطان حاصل شده و این درحالیست که بیشتر این سیستم‌ها بر پایه‌ی پروفایل ژنومیک، ترنسکریپتومیک و پروتئومیک[5] سلول‌های سرطان است. پژوهش‌های اخیر که در زمینه‌ی آنالیز تک‌سلول انجام شده توانسته ناهمگنی رونویسی یا ترانویسی[6] ، برنامه‌های سلول بنیادی، حساسیت دارویی و انباشتگی تغییرات آنکوژن در سرطان‌های متاستاتیک را با موفقیت تشخیص دهند. این روش‌ها همچنان برپایه‌ی تقویت تعداد کمی‌ از متریال ژنتیکی از هر سلول و تجهیزات بسیار تخصصی هستند و به فرکانس پایین حساسند، به همین‌دلیل برای استفاده‌ی متداول در کلینیک‌ها نامناسب می‌باشند. ازاین‌رو، شیوه‌های دیگری برای تشخیص سرطان در‌حال‌بررسی اند. ‌یکی از این راه‌ها توسعه‌ی پلتفرم دقیقی برای اعمال تکنیک‌های مشخصه‌یابی بیوفیزیکی می‌باشد که مقرون‌به‌صرفه و آسان است.

بیوفیزیک سرطان
روش‌های سنتی شناسایی و مشخصه‌یابی سلول‌های سرطانی و پیشرفت بیماری برپایه‌ی تغییرات در آرایش درونی ژنتیکی است که باعث رشد کنترل نشده می‌گردد. هرچند این تغییرات بیوشیمی‌ درقالب ویژگی‌های بیوفیزیکی و عملکردی ظاهر می‌‌شوند که (1) به سلول‌های سرطانی اجازه می‌‌دهد جان سالم به در ببرند و در شرایط سخت نیز رشد کنند (2) به آنها کمک می‌کند از تومور اولیه مهاجرت کنند و (3) می‌تواند راهی موثر برای مشخصه‌یابی و شناسایی سلول‌های سرطانی باشد. بنابراین، طی دو دهه‌ی گذشته، موجی از پژوهش‌ها در زمینه‌ی ویژگی‌های بیوفیزیکی سرطان به جریان افتاده است. از مهم‌ترین ویژگی‌های بیوفیزیکی می‌توان به مکانیسم سلول‌های سرطانی و میکرومحیط تومور[7] و همچنین خواص دی‌الکتریک و نوری سلول اشاره کرد که در ادامه به آن می‌پردازیم. 

نشانگرهای مکانیکی
یکی از تغییرات اولیه‌ی مربوط به سرطان‌زایی، تغییرات ساختاری و مکانیکی سلول‌هاست که به آن‌ها اجازه می‌دهد سریعا جدا شوند، کوچ کنند و در میکرومحیط تومور حمله‌کنند. افزون‌براین، به‌دلیل ناهمگنی بیماری این تغییرات مکانیکی نه نتها به مرحله‌ی سرطان بلکه به بافت خاستگاه نیز وابسته‌اند. هرچند سختی مطلوب به‌طور گسترده‌ای برای انواع مختلف سلول‌های به‌هم چسبیده متفاوت است، بطورکلی تکثیر و تفکیک سلول مطابق با سختی آن افزایش می‌‌یابد.

تغییرات مکانیکی تنها محدود به خود سلول‌های سرطانی نیستند. سختی ماتریس خارج سلولی تومور (ECM)[8] با رشد تومور تغییر می‌کند و باعث تغییراتی در تعاملات نیرو میان سلول‌های سرطانی و محیط اطرافشان می‌گردد. آرایش ژنوتیپ و فنوتیپ دیگر سلول‌ها در فیبروبلاست‌های[9] بستره[10] تومور نیز با رشد تومور تغییر می‌کند و نقش بسزایی در تغییرات خواص فیزیکی ECM ایفا می‌‌کند. این ارتباط دوطرفه میان سلول‌های تومور و محیطشان، نشانه‌های مهم سرطان مانند رشد کنترل‌نشده، فرار از مرگ، متوقف‌سازی سیستم ایمنی[11]، تشکیل طبیعی رگ‌های خونی[12]، تحرک و حمله سلول‌های سرطانی از طریق غشا بازال به رگ‌های خونی با لنفاد[13] را کنترل می‌کند. بنابراین اندازه‌گیری‌های کمّی‌ این تغییرات مکانیکی درطول تومورزایی، اطلاعات مهمی‌ درباره‌ی تبدیل فنوتیپ عادی به بدخیم در اختیار ما قرار می‌دهد. تکنیک‌های بیوفیزیکی از جمله کشیدن غشا، میکروسکوپ نیروی اتمی‌، مکش میکروپیپت، پنس نوری و پنس مغناطیسی بطور گسترده‌ای برای اندازه‌گیری ویژگی‌های مکانیکی سلول‌های سرطانی استفاده می‌‌شوند. هرچند پیشرفت قابل‌ملاحظه‌ای در رویکرد‌های مذکور دیده شده اما پیچیدگی پیاده‌سازی، تجهیزات سنگین، تخصص فنی و راندمان کم استفاده از آن‌ها را محدود کرده‌است.

نشانگر دی‌الکتریک
خواص الکتریکی سلول‌ها با سرطان‌زایی تغییر می‌کند و می‌تواند به‌عنوان نشانگر جایگزین برای ارزیابی پتانسیل تومورزایی و متاستاتیک بکار رود. همانطور که ساختار و ترکیب سلول همگام با پیشرفت سرطان تغییر می‌کند، ظرفیت غشا و رسانایی سیتوپلاسمی با شرایط سازگار شده و این، تغییراتِ فنوتیپیک را نشان می‌دهد. زمانی که غشای سلول (شامل دولایه فسفولیپید[14]) مسئول ترکیب خازنی امپدانس سلول است، کانال‌های ‌یونی میان‌غشایی[15] و سیتوپلاسم با ترکیب رسانا همکاری می‌‌کنند. تغییرات در چگالی کانال‌ یونی بر روی غشای سلول و نوسانات در پتانسیل غشا عموما همگام با سرطان‌زایی در قاعده‌ی تبادلات بیوشیمی‌ میان سلول‌ها و محیط‌شان می‌باشد. افزون‌براین، سلول‌های سرطانی به‌علت افزایش مقدار آب سیتوپلاسمی‌، افزایش نفوذپذیری غشا و تغییرات در بسته‌بندی سلولی، از رسانایی بالاتری برخوردارند.

طیف سنجی امپدانس الکتریکی (EIS) و دی‌الکتروفرسیس[16] (DEP) دو روش معمول برای تعیین ویژگی‌های الکتریکی سلول‌ها و بافت‌ها هستند. EIS ابزاری قدرتمند برای آنالیز‌های بدون برچسب و بررسی ویژگی‌های سلول‌های زیستی است، و اطلاعاتی درباره‌ی ظرفیت غشا و رسانایی سیتوپلاسمی‌ در طیفی از تناوب‌ها ارائه می‌دهد. در مقابل، DEP نیرویی است که تحت تاثیر‌ یک میدان الکتریکی غیر‌یکنواخت خارجی به ‌یک ذره‌ی قطبی‌شده وارد می‌‌شود و برای طبقه‌بندی سلول‌ها و مرتب‌سازی آن‌ها برپایه‌ی ویژگی‌های دی‌الکتریک ذاتی سلول مورد استفاده قرار می‌گیرد.

نشانگرهای نوری
تغییرات ساختاری و ترکیبی در سلول‌های مربوط به تومورزایی، همانند  ویژگی‌های مکانیکی و الکتریکی، باعث تغییرات در ویژگی‌های ذاتی نوری می‌‌شود. ویژگی‌های نوری سلول مانند شاخص شکست، جذب و پراکندگی به‌عنوان تابع تغییرات فنوتیپ سلولی و غلظت نمک درون‌سلولی تغییر می‌کنند، بنابراین به‌عنوان  ابزاری برای تشخیص حالت بیماری تحت شرایط مختلف از جمله سرطان به‌کار می‌رود. اندازه‌گیری شاخص شکست برای تمایز میان سلول‌های سرطان پروستات و سلول‌های عادی سطحی پروستات به‌طور موفقیت‌آمیزی استفاده شده است. افزون‌براین، تفاوت فاحشی میان جذب و پراکندگی طول‌موج‌های مشخصی در بافت عادی پوست و بافت‌های سرطانی وجود دارد. به‌همین‌ترتیب، پژوهش‌های گذشته نشان داده است که روش‌های تشخیص نوری برپایه‌ی لیزر برای اندازه‌گیری جذب و شکست غیرخطی بافت دهان می‌تواند با موفقیت نمونه‌های عادی و سرطانی را متمایز نماید.

آزمایشگاه بر روی تراشه برای بیوفیزیک تک‌سلول سرطان
شاخه‌ی پژوهش سرطان به‌طور فزاینده‌ای نقش و تاثیر ویژگی‌های بیوفیزیک سلول بر پیشرفت سرطان و متاستاز را تصدیق می‌‌کند، اما اجرای این روش‌ها به‌طورگسترده پیشرفت چندانی نداشته است. دلیل بخشی از این امر، نیاز به تجهیزات سنگین و تخصصی به همراه متخصصین برای این نوع آنالیز می‌باشد. پیشرفت‌های اخیر در فناوری میکروفلویدی اجرای برنامه‌های متنوع پزشکی را در زمینه‌ی استفاده از اندازه‌ی نمونه در پلتفرم‌های دستی LOC، سریع‌تر، ارزان‌تر، آسان‌تر و کارآمدتر کرده است. برخی از نقاط‌قوت آزمایشگاه بر روی تراشه شامل پاسخ سریع‌تر و زمان آنالیز کوتاه‌تر، هزینه‌ی کمتر، اندازه‌ی کوچک‌تر، استفاده‌ی آسان و نیاز به نمونه با حجم بسیار پایین می‌باشد، بنابراین می‌تواند کلیدی برای رسیدن به این هدف باشد. هرچند بیشتر این دستگاه‌ها بر اساس آزمایش‌های بیوشیمی‌ مانند آنالیز ژنومیک و سمیّت بوده است، اخیرا تلاش برای توسعه‌ی مشخصه‌یابی بیوفیزیکی نمونه‌ها در جریان است. همانطور که پیش‌تر گفته شد، ناهمگنی درون‌توموری (در سطح سلولی) و میان‌توموری (در سطح جمعیت بیمار) سرطان را به بیماری ایده آلی برای مشخصه‌یابی برپایه‌ی تک‌سلول  بوسیله‌ی پلتفرم‌های LOC تبدیل کرده است (شکل1). با اینکه پیشرفت بسیار چشم‌گیری در زمینه‌ی پلتفرم LOC انجام شده، اما تعداد بسیار کمی‌ از پژوهش‌ها بر مشخصه‌یابی بیوفیزیکی سلول‌های سرطان در سطح تک‌کلون تمرکز دارد. بخش زیر بر پلتفرم‌هایی اشاره دارد که بطور ویژه برای تعیین خواص بیوفیزیکی در سطح تک‌سلول در انواع مختلف سرطان (خلاصه شده در جدول1) طراحی شده اند و برخی از پیشرفت‌های اخیر را در این شاخه نشان می‌دهد.

مشخصه مکانیکی
تغییرات فنوتیپی درطول پیشرفت تومور، بخش بسیار مهمی‌ از تاکتیک‌های زنده ماندن سلول‌هاست که به آن‌ها اجازه می‌دهد خود را با تغییرات میکرومحیط وفق دهند و آزاد شدن از تومور اولیه و استقرار در مناطق دورتر استراتژی‌هایی به‌کارگیرند. سلول‌های [17]CTC عموما بزرگ‌تر از سلول‌های عادی هستند و این ویژگی در تشخیص آن‌ها برپایه‌ی اندازه در نمونه‌های خون به‌طور گسترده‌ای استفاده می‌‌شود. به‌علاوه، تغییر در ساختار سیتواسکلتی[18] سلول‌های سرطانی منجر به تغییر در سختی سلول می‌‌شود. این تغییرات اطلاعات مهمی‌ درباره‌ی پتانسیل متاستاتیک سلول‌ها در اختیار ما قرار می‌دهند. روش‌های سنتی اندازه‌گیری این تغییرات مانند میکروسکوپ نیروی اتمی‌، بسیار دشوار و با راندمان پایین هستند، بنابراین پلتفرم‌های LOC با اندازه‌گیری تغییرات در سختی تک‌سلول می‌توانند دسترسی به چنین روش‌های مشخصه‌یابی را ممکن سازند. برای مثال، سیستمی‌ که توسط لین و همکارانش ارائه شد، نه تنها از اندازه‌ی سلول بلکه از قابلیت تغییرشکل سلول به‌عنوان معیاری برای جداسازی سلول سرطانی از خون استفاده می‌‌کند. این سیستم دو مرحله‌ای ابتدا سلول‌ها را بر اساس اندازه دسته‌بندی می‌‌کند و سپس از آرایش دوبعدی میکروساختار شیپوری شکل با کاهش ابعاد استفاده می‌‌کند تا سلول‌های سازگارتر را در انتها جمع‌آوری کند. 

به طورکلی، قابلیت تغییرشکل سلول‌های سرطانی در پلتفرم میکروفلویدی با استفاده از کانال‌های انقباض و اندازه‌گیری حرکت سلول در این کانال‌ها بدست می‌آید (شکل2-الف). اندازه‌ی انقباض‌ها کوچک‌تر از اندازه‌ی معمول سلول عادی بطوریکه سلول می‌بایست درون کانال فشرده شود. آدامو[19] و همکارانش نشان داده‌اند که زمان حرکت سلول درون ‌یک ریزانقباض شیپوری شکل با اندازه و سختی سلول رابطه مستقیم دارد (مثلا سلول بزرگتر و سخت‌تر در زمان طولانی‌تری از کانال می‌گذرد). آن‌ها ازین اصل استفاده کردند تا برای اندازه‌گیری نیمه‌کمّی‌ سختی سلول‌های سرطانی راهی سریع‌تر ارائه دهند. افزون‌براین، خان و واناپالی[20] سیستمی‌ ارائه داده‌اند که علاوه بر اندازه‌گیری زمان ورود سلول و میزان کشیدگی، افت فشار در حضور سلول نیز با مانومتر میکروفلویدی محاسبه می‌‌شود. نتایج آن‌ها نشان می‌دهد که سلول‌های خوش‌خیم و بدخیم مغز بر اساس زمان ورودشان به ریزانقباض متفاوتند، حال آنکه سرعت سلول، کشیدگی و افت فشار تفاوت چندانی نداشتند.

دستگاه ریزانقباضی که بیون[21] و همکارانش ارائه دادند‌ یک تشدیدکننده‌ی میکروکانال معلق (مانند ‌یک پایه‌ی سیلیکونی مستقر در میکروکانال خالی که فرکانس تشدید آن با عبور سلول از قسمت‌های مختلف کانال تغییر می‌کند) در کانال میکروفلویدی ایجاد می‌کند تا توده‌های شناور سلول‌ها را همراه سرعت ورود و خروجشان از تنگه اندازه‌گیری کند. آن‌ها نشان دادند بااینکه سرعت ورود تابع قابلیت تغییرشکل سلول است، سرعت خروج ارتباط تنگاتنگی با اصطکاک میان سلول و سطح کانال دارد (شکل3-الف). اندازه‌گیری سلول‌های سرطانی مختلف نشان می‌دهد که سرعت سلول زمانیکه به توده‌ی شناور می‌چسبد در تشخیص سلول‌ها بر اساس پتانسیل متستاتیک بسیار کارآمد است.

اندازه‌گیری برپایه‌ی کانال انقباضی می‌تواند ذاتا آهسته و وابسته به اندازه‌ی سلول سرطانی باشد. بنابراین برای غلبه بر این مشکلات این طرح دستخوش تغییراتی بوده است. برای مثال، گوا[22] و همکارانش ‌یک‌سری توالی انقباض با اندازه‌ی رو به کاهش را در دستگاهشان ارائه دادند تا بر مشکل اندازه‌ی انقباض نوری برای سلول‌های مختلف غلبه کنند. این کار به آن‌ها اجازه داد تا فشار نوری وابسته به سایز سلول را شناسایی کنند.

برای نشان دادن راندمان کم سیستم‌های ریزانقباضی، ماک و اریکسون[23] آرایشی از میکروپیپت‌ها پیشنهاد دادند جاییکه در سراسر کانال پیوسته بطور مساوی افت فشار اعمال می‌‌شود تا بدون هیچ اتوماسیون خارجی و مهمی‌، قابلیت تغییرشکل پذیری سلول را با راندمان بالاتر اندازه بگیرند. این طراحی نیز اندازه‌گیری‌های پیاپی از قابلیت تغییرشکل پذیری و سستی سلول به‌عنوان روشی برای شبیه‌سازی رفتار تهاجمی‌ سلول سرطانی ارائه می‌دهد، جاییکه سلول‌ها در منافذ کوچک ECM فشرده می‌‌شوند. طراحی مشابهی از آرایش میکروپیپت توسط لی و لیو[24] انجام شده که کنترل خودکار فشار بر هر سلول در کانال انقباضی و پردازش خودکار تصاویر برای محاسبه‌ی ویژگی‌های مکانیکی مانند مدول‌یانگ و فشار پوسته[25] را ممکن می‌سازد. در استراتژی ارائه شده توسط لانگ[26] و همکارانش ورود سلول به آرایش انقباضی مجسم شده و بوسیله‌ی سیستم خودکار پرسرعت اندازه‌گیری می‌‌شود. آن‌ها از مدل رئولوژی زمان ثابت استفاده کردند تا رابطه‌ی توان زمان ورود سلول با فشار محرک و قابلیت تغییرشکل سلول را پیش‌بینی کنند. این کار به منظور افزایش سرعت اندازه‌گیری و در نتیجه افزایش راندمان کلی دستگاه انجام می‌گیرد. علاوه بر سیستم‌های انقباضی، سیستم‌های میکروالکترومکانیکی نیز برای اندازه‌گیری سختی سلول بکار می‌روند. بیتنز[27] و گروهش سیستمی‌ پیشنهاد دادند که طبق آن در کانال میکروفلویدی جهت اندازه‌گیری بلادرنگ قطر، سختی و ضایعات چسبنده سلول از نانوپنس‌های سیلیکونی استفاده می‌‌شود. پنس‌ها دو سر دارند ــ سر فشرده با محرک و سر حسی با حسگر جایگزنی کامل می‌‌شوند. نوسانات منظم سر حسی برای اندازه‌گیری بلادرنگ ویژگی‌های سلول بکار می‌رود. این دستگاه پلتفرم فشرده‌ای به منظور مشخصه‌یابی بلادرنگ مکانیک سلول‌های سرطانی در اختیار ما قرار می‌دهد.

ویژگی‌های الکتریکی
تغییرات در ویژگی‌های الکتریکی/دی‌الکتریکی سلول‌ها بدلیل تغییرات در ساختار سیتواسکلتی و ترکیب سیتوپلاسم درطول مدت تومورزایی، راه‌های مهمی‌ برای شناسایی سلول‌های سرطانی در اختیار ما قرار می‌دهد. به دام انداختن انتخابی تک‌سلول‌های سرطان در مجموعه‌ی سلول‌های سالم (مثلا بافت‌خونی)‌ یا در مجموعه‌ی سلول‌های سرطان با پتانسیل متاستاتیک متفاوت به منظور تعیین ویژگی‌های بیوفیزیکی بیشتر، چالش بزرگی برای آنالیز تک‌سلول‌های سرطان است. نیروهای میکرومقیاس دی‌الکتروفورتیک در پلتفرم‌های LOC برای دستکاری/کنترل فیزیکی سلول‌های سرطانی بطور فزاینده ای استفاده می‌‌شود.

هونگ[28] و همکارانش با الکترودهای چهارتکه برای جای‌گیری ناهنجار سلول‌ها سیستمی‌ طراحی کردند که به دنبال آن دومین الکترود میکروول به منظور جاگذاری دقیق تک‌سلول در وسط الکترودهای اندازه‌گیری برای آنالیز بیشتر، با استفاده از DEP منفی به کار گرفته می‌‌شود. به همین ترتیب، چانگ و همکارانش نیز برای جایگذاری دقیق سلول‌ها در نانو پلتفرم الکتروپراژ از DEP مثبت به منظور آنالیز و کنترل بعدی ژنتیک استفاده کردند. بتاچاریا[29] و همکارانش در‌ یک دگرگونی عایق DEP مبتنی بر جریان به منظور بهبود پایداری سلول، از دو پایه‌ی جداکننده‌ی اشکی شکل استفاده کردند که با کنترل ولتاژ مستقل در تقاطع چهار کانال میکروفلویدی قرار گرفت. سلول‌های مختلف به‌طور انتخابی از طریق نوسانات ولتاژ اعمال شده در کانال‌ها به دام می‌افتادند. تسای[30] و همکارانش در‌یک سیستم مستقل و فشرده باتری‌دار، تعادلی میان نیروهای الکتروترمال AC و دی‌الکتروفورتیک برقرار کردند.

امپدانس الکتریکی پارامتر دیگری است که برای تعیین ویژگی‌های بیوفیزیکی سلول‌های سرطان در سطح تک‌سلول مورد استفاده قرار می‌گیرد. EIS برای به دام انداختن سلول‌ها میان دو الکترود با پتانسیل اعمال شده و محاسبه‌ی امپدانس در فرکانس‌های مختلف بستگی دارد (شکل2-ب). محاسبه‌ی امپدانس در فرکانس‌های مختلف به ما اجازه می‌دهد تا اجزای خازنی را از اجزای رسانا جدا کنیم. سیستم‌های LOC جهت آنالیز و تمایز میان تک‌سلول‌های سرطان و پتانسیل‌های مختلف متاستاتیک بر اساس امپدانس الکتریکی شان توسط افراد مختلفی ارائه شده است. محاسبه‌ی امپدانس در ولتاژهایی با مقادیر و فرکانس‌های متفاوت جهت شناسایی ویژگی‌های نوری برای تشخیص سلول‌های موردنظر انجام شده است. به‌طورکلی، برای تشخیص سلول‌ها با پتانسیل متاستاتیک مختلف، محاسبه در فرکانس‌های بالاتر احتمالا به دلیل تغییرات سیتواسکلتی مناسب‌تر خواهد بود. در پلتفرمی‌ مشابه، ژائو[31] و همکارانش نه تنها قادر به تمایز میان سلول‌های توموری با تفاوت‌های ژنتیکی جزئی بودند بلکه توانستند میان سلول‌های تومور زینوگرفت (زینوگرفت[32] از سری سلول‌های سرطانی مختلف در موش‌ها ایجاد شده است) نیز تفاوت قائل شوند. علاوه‌براین، آن‌ها موفق شدند محاسبه‌ی امپدانس الکتریکی را با اندازه‌گیری سختی سلول در کانال انقباضی ‌یکسان ترکیب کنند.‌ هانگ و همکارانش نسخه‌ی اصلاح‌شده‌ی دیوار انقباضی را به‌عنوان راهی برای حفظ کارآمدی دستگاه ارائه دادند؛ این امر از طریق پاکسازی با اعمال مکش کنترل شده به درون کانال مسدود شده با قابلیت تغییر شکل انجام می‌‌شود و باقیمانده‌ی سلول‌های گیر افتاده را از میان برمی‌دارد.

بیشتر پلتفرم‌های امپدانس الکتریکی با فرض سلول به‌عنوان ذره ای همگن در میدان الکتریکی‌یکنواخت، امپدانس کلی سلول را به دست می‌آورند چراکه الکترود مسطح دسترسی مستقیم به سلول‌ها ندارند. در سیستم محاسبه‌ی امپدانس برپایه‌ی نانولوله‌های کربنی، که توسط عبدالاحد و همکارانش ارائه شد، نانولوله‌های کربنی عمودی به‌عنوان نانوالکترود عمل می‌‌کنند که می‌توانند بدون آسیب به غشای سلول در آن نفوذ کرده و امپدانس را محاسبه کنند (شکل3-ب). این امر به سیستم اجازه می‌دهد تا متوجه هرگونه تغییر الکتریکی در غشای سلول بسته به پیشرفت فنوتیپ بدخیم شود.

مشخصه‌ی حرکتی
علاوه بر قابلیت تغییرشکل سلول‌های سرطانی، حرکت سلول نیز شاخصه‌ی مهمی‌ در پتانسیل متاستاتیک آنهاست. سلول‌های سرطانی بسته به مکانیسم ساختاری میکرومحیط تومور با استفاده از روش‌های مختلفی از جمله مهاجرت آمیبوئید و مزانشیمال[33]، از میکرومحیط تومور اولیه به بیرون کوچ می‌‌کنند. محاسبه‌ی امپدانس الکتریکی به‌عنوان وسیله‌ای برای اندازه‌گیری کمّی‌ فعل و انفعالات میان سلول‌های سرطانی و زمینه‌شان درنظر گرفته می‌‌شود (شکل3-ج). از این اصل در دستگاه LOC ارائه شده توسط وین[34] و همکارانش برای محاسبه‌ی مهاجرت تک‌سلول سرطانی استفاده شده است. شوارتز[35] و گروهش نیز سیستم میکروفلویدی دیگری برپایه‌ی تراشه طراحی کردند که در آن گرادیان حرارتی ‌هاپتوتاتک[36] و کموتاتیک[37] در کانال میکروفلویدی ایجاد می‌شدند تا مسیر مهاجرت سلول‌ها را هدایت و رفتار مهاجرت تک‌سلول را با استفاده از پلتفرم میکروسکوپی آنالیز کنند. در سیستم طراحی شده توسط گاییگوپرس[38] و همکارانش، رفتار مهاجرت سلول‌های گلویمای وابسته به بیمار بصورت کمی‌ محاسبه می‌‌شود و همچنین کلون‌های تهاجمی‌ تر براساس رفتار مهاجرتی شان جدا می‌‌شوند. این جمعیت‌های جداشده رفتاری به شدت ضدآپویتوز داشته و در مقابل داروهای شیمی‌ درمانی مقاومت بالایی دارند. درحالیکه تمام این سیستم‌ها قادر به به دست آوردن رفتار مهاجرتی در سطح تک‌سلول اند، ابزار دیگری برای جداسازی این جمعیت سلول‌ها بسته به حرکتشان لازم است. در سیستم طراحی شده توسط چِن و همکارانش، کانال‌های میکروفلویدی به منظور مشاهده‌ی مهاجرت تک‌سلول‌ها در هر کانال ازطریق شبیه‌سازی فضای محدود عروق لنفاوی و همچنین برای جمع‌آوری این سلول‌ها بر اساس سرعت مهاجرت کموتاکتیک آن‌ها برای آنالیز بیشتر ایجاد شدند.

مشخصه نوری
همانند دیگر ویژگی‌های فیزیکی، تغییرات در ترکیب سیتوپلاسمی‌ درطول پیشرفت سرطان نیز همراه با تغییراتی در ویژگی‌های نوری است.‌یکی از مهم‌ترین شاخص‌ها، شاخص شکست است که بطورکلی در سلول‌های سرطانی بالاتر از سلول‌های عادی است. پژوهش‌های اخیر در زمینه‌ی تعیین ویژگی‌های سلول‌های سرطان براساس شاخص شکست توسط شینگ[39] و همکارانش انجام شده و در آن از حسگر‌های نوری برپایه‌ی گرافن استفاده شده است. ضمن عبور سلول‌ها از کانال میکروفلویدی، دستگاه تغییرات در شاخص شکست را به شکل سیگنال‌های ولتاژ ثبت می‌‌کند (شکل3-د). این امر شاخص شکست در سطح تک‌سلول را با سرعت بسیار بالا و بسیار دقیق محاسبه می‌‌کند. چوی[40] و همکارانش سیستم دیگری ارائه دادند که ویژگی‌های سلول‌های سرطانی را با استفاده از شاخص شکست تعیین می‌‌کند. این سیستم نقشه‌ی کمی‌ و سه بعدی از شاخص شکست تک‌سلول و اندام‌های داخلی فراهم می‌‌کند. این شیوه بر اساس بازسازی توموگرافی سه بعدی شکست است که از تجسم تصاویر کمی‌ استفاده می‌‌کند.

جمع‌بندی
طی دهه‌های گذشته، پلتفرم‌های میکروفلویدی برای تعیین ویژگی‌های تک‌سلول توجه بسیاری از پژوهشگران را به خود جلب کرده اند. با این حال، تاکنون در توسعه‌ی پلتفرم، بهینه سازی راندمان و دقت بیش از دیگر جنبه‌ها حائز اهمیت بوده است چرا که این دو همچنان چالش‌های بسیار مهمی‌ در این شاخه به حساب می‌آیند. افزون بر این، بیشتر تلاش‌های پژوهشی و تجاری‌سازی محدود به پیاده‌سازی شیوه‌های مشخصه‌یابی سنتی همچون ژنومیکس و پروتئومیک در پلتفرم‌های LOC بوده است. با پیشرفت علم و اطمینان به روش‌های مشخصه‌یابی بیوفیزیکی، و ارتباط آنها با تشخیص و رژیم درمانی سرطان، به منظور توسعه‌ی پلتفرم‌های LOC برای آنالیز ویژگی‌های بیوفیزیکی تک‌سلول‌های سرطان بیش از پیش می‌بایست تلاش کرد.

اگرچه شاخه‌ی پلتفرم میکروفلویدی برای مشخصه‌یابی بیوفیزیکی سرطان هنوز نوپاست اما‌یکی از بزرگترین معایب سیستم‌های فعلی کمبود اعتبار پزشکی است. برای تعیین کاربرد این سیستم‌ها در شاخه‌ی پژوهش سرطان، بیشتر آن‌ها تنها در زمینه‌ی شمار محدودی از سری سلول‌های نماینده مورد آزمایشگاه قرار می‌گیرند. برای استفاده از این دستگاه‌ها در زمینه‌ی پزشکی می‌بایست آزمایش‌های بسیاری بر نمونه‌های تومورهای وابسته به بیمار انجام گیرد. هرچند مشکل جمع‌آوری نمونه از بیماران به قوت خود باقیست. بیشتر نمونه‌های بافت مستلزم انجماد فوری‌ یا خواباندن در پارافین اند، که هرقدر سازگار با آنالیز ژنومیک/ ترنسکریپتومیکس، ممکن است بر ویژگی‌های عملکردی و بیوفیزیکی اثر سوء بگذارد. بنابراین تعریف روش‌های درست جهت جمع‌آوری نمونه‌ی تومور برای این پلتفرم‌ها نیازمند توجه به‌سزایی است.

افزون‌براین، سیستم‌های فعلی برای آنالیز بیوفیزیکی در سطح تک‌سلول نیازمند سوسپانسیون تک‌سلول برای پلتفرم میکروفلویدی است تا کارآمدتر عمل کند. این به معنای حذف هرگونه ECM و محیط بومی‌ تومور پیش از آزمایش ویژگی‌های بیوفیزیکی سلول است. این ‌یکی از بزرگترین مشکلات سیستم‌های این چنینی است که میکرومحیط (که در آن سلول‌های تومور ساکن هستند و این رفتار عملکردی/بیوفیزیکی تومور (از طریق ECM-سلول و فعل و انفعالات سلول-سلول) نشان می‌دهد) درطول مشخصه‌یابی حضور ندارد. به‌علاوه، استانداردسازی ویژگی‌های بیوفیزیکی درمیان انواع مختلف سرطان و بیماران مشکلی است که همچنان بی پاسخ مانده چراکه پژوهش‌های فعلی تنها بر طراحی راه‌هایی برای طبقه‌بندی و مشخصه‌یابی سلول‌های سرطان تنها از منابعی محدود متمرکزند.

بااینکه ما هنوز ابتدای راهیم، هدف‌نهایی توسعه‌ی سیستم‌های قابل انتقال و کم هزینه‌ای برای مشخصه‌یابی سرطان در سطح تک‌سلول برپایه‌ی ویژگی‌های عملکردی و بیوفیزیکی آن‌ها با کمترین اختلال در میکرومحیط بومی‌ است.

منبع:

Lab-on-a-Chip Platforms for Biophysical Studies of Cancer with Single-Cell Resolution, Shukla, Vasudha C. et al., Trends in Biotechnology, Volume 36, Issue 5, 549 - 561.