1
ستاد ویژه توسعه فناوری نانو Iran Nanotechnology Innovation Council بستن
  • ستاد ویژه توسعه فناوری نانو

  • بانک اطلاعات شاخص های فناوری نانو

  • سایت جشنواره فناوری نانو

  • سیستم جامع آموزش فناوری نانو

  • شبکه آزمایشگاهی فناوری نانو

  • موسسه خدمات فناوری تا بازار

  • کمیته استانداردسازی فناوری نانو

  • پایگاه اشتغال فناوری نانو

  • کمیته نانو فناوری وزارت بهداشت

  • جشنواره برترین ها

  • مجمع بین المللی اقتصاد نانو

  • اکو نانو

  • پایگاه اطلاع رسانی محصولات فناوری نانو ایران

  • شبکه ایمنی نانو

  • همایش ایمنی در نانو

  • گالری چند رسانه ای نانو

  • تجهیزات فناوری نانو

  • صنعت و بازار

  • باشگاه نانو

مقاومت باکتریایی به نانوذرات نقره و چگونگی غلبه بر آن

افراد مقاله : ‌ مترجم - نجمه نجم الدین , مترجم - ریحانه سادات فرهادی

موضوع : آموزش و ترویج - علم و پژوهش - استاندارد و ایمنی کلمات کلیدی : نانوذرات - نقره - ضد باکتری تاریخ مقاله : 1397/07/04 تعداد بازدید : 529

نانوذرات نقره با موفقیت در فناوری‌های مختلف زیست پزشکی و ضد میکروبی و محصولات مورد استفاده در زندگی روزمره به کار گرفته شده است. به رغم آنکه مقاومت باکتریایی به آنتی بیوتیک‌ها به طور گسترده در منابع علمی مورد بحث قرار گرفته شده است، احتمال افزایش مقاومت باکتریایی به نانوذرات نقره به طور کامل مورد بررسی قرار نگرفته است. گزارش شده است که باکتری‌های گرم منفی اشرشیا کولای 013، سودومونا آئروجینوزا CCM 3955و ای.کولای CCM 3954 می‌توانند پس از مواجهه مکرر، در برابر نانو ذرات نقره مقاومت کنند. این مقاومت ناشی از تولید تاژک ، پروتئینی فلاژلین چسبنده¬ای است که باعث تشکیل توده نانوذرات می‌شود. این مقاومت بدون تغییر ژنتیکی تکامل می‌یابد؛ تنها تغییر فنوتیپیک جهت کاهش پایداری کلوئیدی نانوذرات مورد نیاز است و بدین ترتیب فعالیت آنتی باکتریال آن‌ها از بین می‌رود. مکانیسم مقاومت را با استفاده از افزودنی‌های تثبیت کننده نانوذرات نقره مانند سورفکتانت‌ها یا پلیمرها نمی توان برطرف کرد. با این حال، جهت غلبه بر این موضوع باید از تولید فلاژلین با استفاده از عصاره پوست انار ممانعت کرد.

 

1. مقدمه
نانوذرات نقره (NPs) و نانوکامپوزیت‌ها به دلیل کارآیی ضد میکروبی بالا، به عنوان نانومواد پرکاربرد در زمینه کاربردهای پزشکی و بیوتکنولوژی مورد توجه قرار می‌گیرند. استفاده از نانوذرات نقره در کاربرد‌های پزشکی بسیار مورد توجه قرار گرفته است. علت این امر افزایش مقاومت باکتریایی به آنتی بیوتیک‌ها است که اثربخشی درمان آنتی بیوتیک را برای بیماری‌های عفونی محدود کرده است. نانوذرات نقره در غلظت‌های مشخصی دارای فعالیت ضد باکتری بالایی هستند که برای سلول‌های انسانی سمیتی ندارند و از طرفی می‌توانند فعالیت ضد باکتری آنتی بیوتیک‌های معمولی را حتی در برابر باکتری‌های مقاوم از طریق اثرات هم افزایی افزایش دهند. در حال حاضر نمی توان اظهار نظر کرد که آیا نانوذرات نقره می‌توانند در پزشکی برای افزایش اثربخشی آنتی بیوتیک‌ها مورد استفاده قرار گیرند یا در عفونت‌های موضعی و سیستمیک به طور کامل جایگزین آنتی بیوتیک‌ها شوند. با این حال، اکنون زمان آن رسیده است که توسعه بالقوه مقاومت باکتریایی به نانوذرات نقره مورد توجه قرار گیرد.

 نقره در شکل‌های مختلف (نقره فلزی، نمک‌های نقره و نقره کلوئیدی) به عنوان عامل ضد باکتری موثر برای قرن‌های متمادی مورد استفاده قرار گرفته است و فعالیت آنتی باکتریایی مؤثر خود را در این دوره حفظ کرده است. تاکنون، هیچ گزارش قطعی در مورد توسعه مقاومت باکتریایی به نانوذرات نقره وجود ندارد. با این حال، برخی از گزارش‌های مربوط به مقاومت باکتریایی به نقره یونی موجود است. چنین مقاومتی ممکن است شامل کاهشAg+ به حالت اکسیداسیون خنثی با سمیت کمتر یا جریان فعالAg+ از سلول توسط آدنوزین تری فسفاتازهای نوع P یا حامل‌های شیمیاییAg+ /H+ باشد. علاوه بر این، تعدادی از مطالعات اخیر شواهدی دال بر مقاومت باکتری یا کاهش حساسیت به نانوذرات نقره ارائه کرده اند. اکثر این مطالعات مکانیسم‌های مقاومت بر اساس حذف فرم‌های یونی نقره، را مطرح کرده اند. از سوی دیگر، در مقایسه با تجویز گسترده، طولانی مدت و مکرر آنتی بیوتیک‌های کلاسیک یا فرم‌های یونی نقره (به عنوان مثال سولفادیازین نقره)، استفاده از نانوذرات نقره در کاربردهای پزشکی به استثنای نقره کلوئیدی در یک دوره کوتاه در آغاز قرن بیستم، رایج نبوده است. بنابراین، روشن نیست که آیا باکتری‌ها می‌توانند نسبت به نانوذرات نقره مقاومت نشان دهند. تنها پژوهش انجام شده به منظور بررسی رفتار باکتری در پاسخ به مواجهه طولانی مدت و مکرر با نانوذرات نقره نشان می‌دهد که در میان گونه‌های باکتری، تنها باکیلوس سابتیلیس[7] دارای توانایی طبیعی برای سازگاری با استرس اکسیداتیو بافت سلولی را دارد؛ این استرس ناشی از لیچینگ[8]Ag+ در اثر مواجهه طولانی مدت با نانوذرات نقره حمل شده توسط TiO2 بلورین است. علی رغم این تلاش ها، هنوز بحث‌هایی در مورد مقاومت باکتریایی به نانوذرات نقره هنگام مواجهه طولانی مدت با غلظت‌های نقره زیر بازدارندگی، وجود دارد.

در اینجا مکانیسم جدیدی توصیف شده است که توسط آن باکتری‌هایی که در ابتدا حساس به نانوذرات نقره هستند، پس از مواجهه با غلظت‌های زیرِ بازدارندگی نانوذرات نقره، می‌توانند در برابر اثرات سمی آنها مقاوم باشند. این مکانیسم براساس تولید فلاژلین پروتئین تاژک باکتریایی است که باعث تجمع نانوذرات نقره می‌شود و بنابراین اثر ضد باکتریایی آن را بر علیه باکتری‌های گرم منفی مهار می‌کند.

 

2. ایجاد مقاومت باکتریایی به نانوذرات نقره
حداقل غلظت بازدارندگی نانوذرات نقره به صورت تدریجی و آهسته افزایش می‌یابد.
به منظور دستیابی به اهداف این مطالعه، روش قابل اعتماد و شناخته شده تولنس[9] اصلاح شده برای تهیه نانوذرات نقره با قطر nm 28 و غلظت mgl-1108 مورد استفاده قرار گرفت. توزیع باریک اندازه نانوذرات نقره سنتز شده توسط میکروسکوپ الکترونی عبوری  (TEM) و حضور پیک جذب پلاسمون سطحی باریک در  nm 405 در طیف اشعه ماورای بنفش/ مرئی (Vis / UV) تأیید گردید. نانوذرات نقره سنتز شده در این روش، دارای حداقل غلظت بازدارندگی (MICs)[10] پایین نسبت به باکتری‌های غیرانتخابی در بازه 69/1 تا mgl-1 5/13 (جدول 1) است که نشان دهنده فعالیت آنتی باکتریایی بالای این نانوذرات است. در حضور این نانوذرات، 20 مرحله متوالی کشت باکتری انجام گردید. به گونه­ای که در هر آزمون گونه باکتری موجود در محیط کشت حاوی غلظت نقره زیر بازدارندگی بوده است و MICs نانوذرات نقره پس از هر مرحله کشت تعیین گردید (جدول 1). اولین گونه باکتری که مقاومت قابل توجهی در برابر نانوذرات نقره از خود نشان داد، ای.کولای CCM 3954 بود. پس از ششمین مرحله کشت، MIC برای این گونه ( mgl-15/13) به طور قابل توجهی بیشتر از گونه مرجع ( mgl-138/3) است. در هشتمین مرحله، MIC به mgl-154 افزایش یافت. به طور مشابه، پی آئروجینوزا CCM 3955 و ای.کولای 013 به ترتیب در مراحل 11 و 13 به نانوذرات نقره مقاومت نشان دادند. تمام گونه‌های باکتری مورد آزمایش، مقاومت خود را به نانوذرات نقره بین مراحل 13 تا 20 حفظ کردند (جدول 1). این نتایج به وضوح نشان می‌دهد که تمام گونه‌های باکتری مورد آزمایش پس از مواجهه مکرر، نسبت به نانوذرات نقره مقاومت نشان می‌دهند. در ادامه MICs نهایی نانوذرات نقره در برابر این گونه‌های «مقاوم به Ag» تعیین گردید که از پراکندگی نقره با غلظت‌های بالای mgl-1432، با فرایندی مشابه با سنتز نانوذرات اولیه استفاده می­کند. نتایج بدست آمده نشان می‌دهد که تمام باکتری‌های «مقاوم به Ag» نسبت به گونه‌های اولیه «حساس به Ag» مقادیرMIC بالاتری را نشان می‌دهند. به عنوان مثال، MIC برای ای.کولای CCM 3954 از 38/38 به mgl-1 108، برای پی.آئروجینوزا CCM 3955 از 69/1 به mgl-1 54 و برای ای.کولای 013 از 5/13 به mgl-1 108 افزایش یافت.

 جالب توجه است که در طی مجموعه­ای از آزمایش‌های موازی که در آن از یون نقره به جای نانوذرات Ag در محیط کشت استفاده شد، افزایشی در MICs مشاهده نشد. در نتیجه مقاومت باکتریایی به یون نقره تحت شرایط آزمایش ایجاد نگردید. علاوه بر این، MICs برای یون نقره در برابر باکتری‌های مقاوم به نانوذرات نقره معادل مقاومت باکتریایی گونه‌های اولیه غیر مقاوم است. این موضوع موید آن است که مکانیسم مقاومت باکتریایی در مقابل نانوذرات نقره برای یون نقره ناکارآمد است. به نظر می‌رسد مقاومت باکتریایی ایجاد شده در برابر نانوذرات نقره تنها مختص فرم نانوذره نقره است.

 

3. تشکیل توده و رسوب نانوذرات نقره
مقاومت باکتری به نانوذرات نقره همراه با تشکیل تدریجی توده و رسوب نقره در زیر چاهک‌های میکروپیلت حاوی گونه‌های باکتری «مقاوم به Ag» است. این مسئله به وضوح در شکل1 قابل تشخیص است. زیرا پس از کشت 24 ساعته با گونه باکتری «مقاوم به Ag» رنگ چاهک از زرد روشن در ابتدای آزمایش به خاکستری سیاه تغییر کرده است (شکل 1). از طرف دیگر، چاهک‌های حاوی گونه‌های باکتریایی «حساس به Ag» و نانوذرات نقره، رنگ زرد خود را حفظ کرده اند که نشان دهنده یک پایداری و پراکندگی یکنواخت سوسپانسیون نانوذرات است که ناشی از جذب پلاسمون سطح نانوذرات است.

پایداری بالای توده نانوذرات نقره پس از کشت با باکتری‌های «حساس به Ag» به وضوح توسط TEM نشان داده شده است (شکل 2 a،b). از طرفی تشکیل توده‌های بزرگ نانوذرات نقره با اندازه‌های مختلف از چند صد نانومتر تا میکرومتر پس از کشت با ای.کولایCCM 3954 «مقاوم به Ag» مشاهده گردید (شکل 2 c،d). این مسئله به وضوح نشان می‌دهد که ای.کولای CCM 3954 «مقاوم به Ag» باعث تشکیل توده نانوذرات نقره می‌شود (شکل 2 e،f) و در نتیجه اثر آنتی باکتریال نانوذرات را از بین می‌برد. به وضوح مشخص است که ذرات و توده‌های بزرگ نقره نسبت به نانوذرات نقره اولیه با پراکندگی مناسب، به طور قابل ملاحظه­ای فعالیت آنتی باکتریایی پایین­تری دارند. بنابراین باکتری‌ها پس از کشت مکرر، قادر به تشکیل توده نانوذرات نقره هستند که منجر به جلوگیری یا حذف کلی اثرات ضد باکتریایی آن‌ها می­شود. پایداری توده و ته­نشینی ذرات کلوئیدی نقش مهمی در حفظ خواص منحصر به فرد آنها از جمله فعالیت بیولوژیکی دارد. بنابراین هر فرآیندی که مانع از ثبات کلوئیدی آنها باشد، می‌تواند به طور قابل ملاحظه ای رفتار آنها را تغییر دهد.

 

4. مکانیسم تشکیل توده نانوذرات نقره ناشی از باکتری
جهت بررسی مکانیزم تشکیل توده، مقاومت باکتری‌های کشت داده شده به دلیل حفظ فعالیت ضد باکتریایی نانوذرات نقره کاهش داده شد که این این کار از طریق افزایش پایداری سطح با استفاده از تثبیت کننده‌های غیر سمی رایج مانند پلیمرها (پلی اتیلن گلیکول و پلی اکریلیک اسید)، ژلاتین پروتئین و سورفکتانت توئین 80[11] صورت گرفت. نمودار رشد و آزمون‌های بقای باکتری نشان داد که هیچ یک از این تثبیت کننده‌ها تأثیر قابل ملاحظه­ای روی رشد و متابولیسم باکتری‌ها نداشته­اند. مهم­تر از همه، آزمایش‌های کشت با استفاده از این تثبیت کننده‌ها به روشنی نشان داد که ای.کولایCCM 3954 «مقاوم به Ag»، مقاومت خود را حتی در مواجهه با نانوذرات نقره با سطح پایدار شده حفظ می‌کند. در واقع، هیچ یک از تثبیت کننده‌های مورد آزمایش، فعالیت ضد باکتریایی نانوذرات نقره را در حضور گونه «مقاوم به Ag» حفظ نمی کنند. این نکته مهمی است؛ زیرا اغلب پلیمرها/ سورفکتانت‌ها به عنوان تثبیت کننده‌های موثر جهت پایداری کلوئید نانوذرات نقره در آب استفاده می‌شوند؛ اما، باکتری «مقاوم به Ag» می‌تواند به سادگی بر این مانع غلبه کند.

همچنین، توانایی نانوذرات نقره برای مهار رشد ای.کولایCCM 3954 «حساس به Ag» و گونه ای.کولای CCM 3954 «مقاوم به Ag»، با کشت روی صفحات آگار حاوی نانوذرات در غلظت‌های mg-1 20 و mg-140 بررسی گردید. گونه‌های باکتری «مقاوم به Ag» کشت داده شده روی صفحات حاوی نانوذرات نقره، در هر دو غلظت مهار نشدند؛ در حالی که رشد گونه‌های «حساس به Ag» به طور کامل مهار شدند. علاوه بر این، توده نانوذرات به وضوح در طول کشت گونه مقاوم در صفحات آگار و پس از آن مشاهده شد. ژل آگار حاوی نانوذرات نقره از رنگ زرد به تدریج در اطراف و در زیر باکتری‌های «مقاوم به Ag» به رنگ خاکستری تبدیل شد.

شایان ذکر است که پایداری توده ذرات کلوئیدی در مایعات، به واسطه رقابت بین جاذبه واندروالس و نیروهای دافعه الکترواستاتیک بین ذرات کلوئیدی با بار سطحی مشابه تعیین می‌شود. پتانسیل زتا نانوذرات نقره مورد استفاده در این مطالعه mV 28- است که ظاهرا برای اطمینان از پایداری طولانی مدت توده کافی است. با توجه به نظریه [12]DLVO (به نام دجاگویین، لانداو، ویوری و اوربیک) که به صورت کمّی توده ذرات کلوئیدیی باردار را با استفاده از ترکیب اثرات جاذبه واندروالس و دافعه الکترواستاتیک (نیروهای کولمبیک) توصیف می‌کند، تشکیل توده می‌تواند با افزودن خنثی کننده­های مناسب و حذف بارهای الکتریکی، سطوح ذرات تحریک شود. تحریک نانوذرات نقره برای تشکیل توده توسط این مکانیزم با استفاده از پلی الکترولیت کاتیونی نشان داده شده است. تشکیل توده نانوذرات نقره به سادگی توسط اسپکتروفتومتری VISUV بررسی می‌شود. طیف جذب نانوذرات نقره در محلول مولر هینتون[13] رقیق شده به نسبت 1:1 (V/V) قبل و بعد از کشت با ای.کولای CCM 3954  «حساس به Ag» و «مقاوم به Ag» در شکل a3 ارائه شده است. باند پلاسمون سطحی مشخصه نانوذرات نقره کلوئیدی با توزیع مناسب در حضور ای.کولای CCM 3954 «مقاوم به Ag» به دلیل تشکیل توده نانوذرات نقره، به تدریج ناپدید گردید. در مقابل، در حضور گونه «حساس به Ag»، شدت باند پلاسمون سطحی، حتی پس از 24 ساعت کشت، بدون تغییر باقی مانده است (شکل a3). این نشان می‌دهد که باکتری‌های «مقاوم به Ag» از طریق ترشح عامل خارج سلولی باعث تشکیل توده نانوذرات نقره می‌شوند که این عامل روی سطوح توده‌ها جذب می‌شود. این عامل احتمالا ماده ای با جرم مولکولی بالا مانند پروتئین است. بنابراین، عصاره‌های پروتئینی تهیه شده با استفاده از حلال‌های مختلف مورد بررسی قرار گرفتند و این کار به وسیله ی آنالیز اسپکترومتری جرمی پروتئومیک (MS)[14] و اسپکترومتری جرمی (MS/MS) برای شناسایی پروتئین‌های تشکیل دهنده توده نانوذرات مشاهده شده صورت گرفت. چندین پروتئین در همه عصاره‌ها شناسایی شدند به جز آنهایی که با استفاده از %1/0 تری فلوئوراستیک اسید (TFA) تهیه شده اند. این پروتئین‌ها شامل آنزیم‌ها و پروتئین‌های ریبوزومی S30 و S50 می‌باشند که در متابولیسم سلولی ای.کولای درگیر هستند و نشان می‌دهد تخریب سلولی تاحدودی قبل یا حین فرایند استخراج رخ می‌دهد.

فراوان ترین پروتئین موجود در عصاره تهیه شده با 5/2% TFA، فلاژلین همراه با پروتئین فیمبریال نوع 1 بود. فلاژلین همچنین یکی از غنی ترین پروتئین‌ها در عصاره‌های تهیه شده با NH4OH رقیق بوده است. در جدول 2 پپتید‌هایی که با توالی فلاژلین مطابقت دارند، نمایش داده شده است.

فلاژلین یک پروتئین باکتریایی است که فیلامنت[16]‌های فیلاژلار[17] خارج سلولی را تشکیل می‌دهد و امکان تحرک باکتری را فراهم می‌کند و پاسخ‌های ایمنی را از طریق گیرنده 5 فراخوانی می‌کند. این پروتئین چسبنده است که (همراه با فلاژلوم) یک عامل حیاتی برای تشکیل بیوفیلم[18] به شمار می‌رود و نقش آن در مراحل اولیه چسبندگی سطحی بسیار مهم است. با این حال، اثرات بالقوه آن بر پایداری توده نانوذرات نقره پیش از این، مورد مطالعه قرار نگرفته است. جهت بررسی نقش فلاژلین در آغاز فرآیند تشکیل توده، یک آزمایش ساده انجام گرفت. در این آزمایش محلول فلاژلین تجاری به نانوذرات نقره رقیق شده در محلول مولرـ هینتون تحت شرایط مشابه با نمونه‌های حاوی محیط کشت و با پراکندگی مناسب اضافه گردید. سپس مخلوط در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت حرارت داده شد. نانوذرات نقره پراکنده زرد رنگ به محض اضافه کردن فلاژلین به رنگ خاکستری درآمدند (شکل a4) و رسوب سیاه نقره در انتهای لوله اپندروف پس از 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد مشاهده گردید (شکل b4) که نشاندهنده نقش فلاژلین در تشکیل توده نانوذرات نقره است.

ایجاد توده به محض افزودن فلاژلین به نانوذرات نقره پراکنده توسط روش‌های اندازه گیری اندازه ذره و پتانسیل زتا و طیف سنج UV/Vis تایید شده است. همان طور که در شکل b3 نشان داده شده، طیف UV/Vis سوسپانسیون نانوذرات قبل و پس از حضور فلاژلین بسیار مشابه به طیف‌های بدست آمده قبل و پس از کشت با ای.کولای CCM 3954 «مقاوم به Ag» است. کاهش شدت پیک پلاسمون سطحی پس از اضافه کردن فلاژلین با روند تشکیل توده سازگار است. علاوه بر این، روش پراکندگی نورپویا نشان داد که بلافاصله پس از افزودن فلاژلین، میانگین اندازه نانوذرات نقره از 28 به 480 نانومتر به دلیل تشکیل توده نقره افزایش می‌یابد. به طور مشابه، پتانسیل زتا سوسپانسیون نانوذرات از mV 28- به mV 2/6- کاهش می‌یابد. کاهش پتانسیل زتا نشان دهنده تضعیف نیروهای دافعه بین نانوذرات برای حفظ نانوذرات به فرم کلوئیدی پراکنده است.

جهت اثبات مجدد نقش حیاتی فلاژلین در تشکیل توده نانوذرات نقره، نقشه­برداری عنصری از توده‌های نقره متصل به سلول‌های باکتریایی انجام گردید که برای این منظور از یک میکروسکوپ الکترونی عبوری با وضوح بالا (HRTEM) مجهز به آشکارساز میدان تاریک حلقوی با زاویه بالا (HAADF )[19] استفاده شد. شکل a5 و b5 به وضوح توده‌های نانوذرات نقره متصل شده به سطح سلول باکتری را نشان می‌دهد. آنالیز نقشه­برداری شیمیایی حضور عناصر پروتئینی مانند کربن، اکسیژن، نیتروژن و گوگرد را بر سطوح توده‌های نقره نشان می‌دهد (شکل 5). عدم حضور نانوذرات قابل رؤیت در داخل سلول در شکل c5 و d5، نشان دهنده آن است که توده‌های نانوذرات نقره به سلول‌های باکتری وارد نمی شوند. تصاویر HRTEM نیز نشان دهنده حضور یک لایه آلی نازک است که احتمالا شامل فلاژلین جذب شده روی سطوح توده‌های نقره (شکل i5 و j5) است. نقشه­برداری عنصری حضور عناصر آلی مورد انتظار فلاژلین (C، O،N و S) را در این لایه سطحی (شکل k5) تایید می‌کند.

در ادامه ارتباط مقاومت باکتریایی به نانوذرات نقره با تغییرات ژنوتیپ یا فنوتیپی مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور، DNA ژنومی کلی از گونه‌های ای.کولای مقاوم و حساس توسط توالی ژنوم کل مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. ترتیب توالی گونه‌های حساس و مقاوم به لحاظ آماری هیچ گونه تغییرات نوکلئوتیدی مرتبط در DNA برای ژن فلاژلار را نشان نداد، که در واقع مشخص کننده پروتئین‌های تشکیل دهنده رشته (fliC)، قلاب (flgE) و پوشش پروتئین (fliD) است؛ در ژن‌های کدگذاری شده تنظیم کننده رونویسی اصلی FlhDC و تنظیم کننده فلاژلار FliA در گونه مقاوم نیز تغییری مشاهد نشد. به عنوان مثال، به لحاظ آماری هیچ تغییرات قابل توجهی بین توالی ژنوم گونه‌های ای.کولای حساس و مقاوم در برابر نانوذرات نقره مشاهده نشد. بدین منظور، بخشی از ژنfliC شامل اولین جفت پایه 428 (bp) توالی ژن (مختصات مرجع توالی 2,001,202–2,001,630 bp در محور افقی) انتخاب گردید. هیچ تفاوت نوکلئوتیدی بین گونه‌های ای.کولای حساس و مقاوم به نانوذرات نقره مشاهده نشد. نوارهای رنگی تنها تغییرات گونه‌های آزمایش شده را در مقایسه با توالی مرجع نشان می‌دهند.

بنابراین به نظر می‌رسد مکانیسم مقاومت نانوذرات نقره شامل ترشح فلاژلین و تشکیل توده بدون نیاز به تغییر ژنتیکی است. با توجه به این موضوع، راه‌های مقابله با این مقاومت، بررسی شده است. نتایج نشان می‌دهد که مهارکننده فلاژلین باکتری ممکن است از تولید پروتئین ممانعت به عمل آورد و بدین گونه مانع از روند تشکیل توده شود. عصاره پوست انار (PGRE)[20] به عنوان یک ماده شناخته شده جهت ممانعت از تولید فلاژلین باکتریایی مورد آزمون قرار گفت. بدین صورت که ای.کولایCCM 3954 «مقاوم به Ag» و گونه‌های ای.کولای 013 «مقاوم به Ag» در حضور نانوذرات نقره و غلظت زیر بازدارندگی PGRE %6/0 (w/w) (مقدار MIC ترکیب PGRE 5/2٪ (w/w) است) کشت داده شد. مشاهده گردید که مقاومت باکتریایی به نانوذرات نقره حذف و فعالیت آنتی بیوتیکی نانوذرات حفظ گردید. به طور خاص، مقادیرMIC برای نانوذرات نقره نسبت به ای.کولایCCM 3954 «مقاوم به Ag» و ای.کولای 013 «مقاوم به Ag» از mg-1 54 به ترتیب به mg-175/6 و mg-15/13 کاهش یافت. مقدار تعیین شده برای گونه ای.کولایCCM 3954 «مقاوم به Ag» نزدیک به MIC گونه حساس اولیه (mg-1 38/3) است و برای ای.کولای 013 «مقاوم به Ag» هم مشابه است.

مقاومت مشاهده شده به نانوذرات نقره پایدار است. زیراMIC برای باکتری «مقاوم به Ag» نسبت به نانوذرات نقره در طی شش دوره کشت در mg-1 108 ثابت باقی مانده است. بنابراین باکتری‌ها مقاومت خود را نسبت به نانوذرات حفظ می‌کنند تا اینکه در طول زمان به حالت حساس تبدیل شوند. بنابراین بیان این موضوع که باکتری‌ها نسبت به نانوذرات نقره مقاوم هستند، منطقی است.

در ادامه ثبات مقاومت آنها توسط آزمایش عصاره انار تایید گردید. پس از انکوباسیون گونه مقاوم با غلظت زیر بازدارندگی عصاره، MIC نانوذرات نقره در mg-1108 باقی ماند و این امر نشان می­دهد که بازگرداندن حساسیت در مواجهه با عصاره می تواند رد شود. این دو آزمون، مکانیزم مقاومتی گونه «مقاوم به Ag» را به نانوذرات نقره تایید کردند.

سومین شاهد موید مکانیزم مقاومتی، توسط اندازه گیری MIC نانوذرات نقره و حداقل زمان مرگ %99 (99MDK)[21] برای سلول‌های باکتریایی ای.کولای CCM 3954 «حساس به Ag» به دست آمده است. MIC گونه «مقاوم به Ag» (با مقدار ثابت mg-1108) نسبت به گونه «حساس به Ag» (mg-1 38/3) بالاتر است. هیچ مقاومتی در گونه ای.کولای «حساس به Ag» در اندازه گیری 99MDK مشاهده نگردید. علاوه بر این، منحنی‌های زمان مرگ برای غلظت‌های مختلف نانوذرات نقره (تهیه شده توسط رقیق­سازی جزء به جزء) به وضوح نشان می‌دهد که اثر کشندگی وابسته به دوز بوده و تا حداقل 10 برابرMIC گونه حساس است. بنابراین امکان مقاومت یا تحمل ای.کولای CCM 3954 در مواجهه با نانوذرات نقره مستثنی می‌شود. به طور خلاصه، نتایج بدست آمده به وضوح یک مکانیسم مقاومتی مخصوص یک دسته از نانوذرات نقره آنتی بیوتیک و نه یون‌های نقره را مشخص می‌کند؛

 

نتیجه گیری
به طور خلاصه، نشان داده شد که مواجهه مکرر باکتری‌ها با غلظت‌های زیر بازدارندگی نانوذرات نقره می‌تواند به سرعت مقاومت در برابر فعالیت آنتی بیوتیکی آن‌ها ایجاد کند. این مقاومت به علت تولید فلاژلین، پروتئین چسبنده فلاژلوم باکتریایی است که باعث تشکیل توده نانوذرات نقره می‌شود و بنابراین اثر ضدباکتریایی آن را علیه باکتری‌های گرم منفی از بین می‌برد. مقاومت باکتریایی ایجاد شده را می‌توان با استفاده از مهارکننده‌های تولید فلاژلین مانند PGRE کنترل کرد. این یافته‌ها مکانیسم‌هایی را توصیف می‌کند که باعث مقاومت باکتریایی به عامل‌های ضد باکتری می‌شود. درک این مکانیسم‌ها در جلوگیری از مقاومت دارویی باکتریایی و مبارزه با باکتری‌های عفونی مفید خواهد بود.

 

منبع

Aleš Panáček, Libor Kvítek, Monika Smékalová, Renata Večeřová, Milan Kolář,Magdalena Röderová, Filip Dyčka, Marek Šebela, Robert Prucek, Ondřej Tomanec and Radek Zbořil, Bacterial resistance to siliver nanoparticles and how to overcome it, Nat Nanotechnol (2018) 13(1):65-71.