1
ستاد ویژه توسعه فناوری نانو Iran Nanotechnology Innovation Council بستن
  • ستاد ویژه توسعه فناوری نانو

  • بانک اطلاعات شاخص های فناوری نانو

  • سایت جشنواره فناوری نانو

  • سیستم جامع آموزش فناوری نانو

  • شبکه آزمایشگاهی فناوری نانو

  • موسسه خدمات فناوری تا بازار

  • کمیته استانداردسازی فناوری نانو

  • پایگاه اشتغال فناوری نانو

  • کمیته نانو فناوری وزارت بهداشت

  • جشنواره برترین ها

  • مجمع بین المللی اقتصاد نانو

  • اکو نانو

  • پایگاه اطلاع رسانی محصولات فناوری نانو ایران

  • شبکه ایمنی نانو

  • همایش ایمنی در نانو

  • گالری چند رسانه ای نانو

  • تجهیزات فناوری نانو

  • صنعت و بازار

  • باشگاه نانو

راه را برای توالی یابی تک مولکول پروتئین هموار می کنیم

افراد مقاله : ‌ مترجم - زهرا اکرمی , مترجم - صادق قربان زاده

موضوع : آموزش و ترویج کلمات کلیدی : توالی‌یابی مولکولی - پروتئین - نانوحفره تاریخ مقاله : 1398/06/05 تعداد بازدید : 274

پروتئین‌ها اصلی‌ترین بلوک‌های ساختاری زندگی هستند. محتوای پروتئینی یک سلول و یک جاندار، اطلاعات مهمی برای فهم فرآیندهای بیولوژیکی و بیماری‌ها در اختیار ما قرار می‌دهد. علیرغم اهمیت تحلیل پروتئین، تنها روش‌های انگشت‌شماری برای تعیین توالی‌های پروتئین در دسترس است که با محدودیت‌هایی از جمله نیاز به مقدار زیادی نمونه، روبه‌رو هستند. روش‌های تک مولکول انقلابی در مطالعات پروتئومیک برپا می‌کنند. در سال‌های اخیر، طرح‌های نوینی برای توالی‌یابی تک مولکول پروتئین مبتنی بر فلوئورسانس، جریان‌های تونل زنی و نانوحفره‌ها پیشنهاد شده است. در اینجا ما مروری بر این رویکردها به همراه اولین تلاش‌های آزمایشگاهی برای تحقق آن‌ها ارائه می‌کنیم. درباره‌ی مزایا و معایب آن بحث می‌کنیم و دیدگاه‌مان را در زمینه‌ی توسعه‌ی روش‌های توالی‌یابی تک مولکول پروتئین توضیح می‌دهیم.

پروتئین‌ها در تمام سلول‌های زنده اسب بارکش هستند. هزاران نوع پروتئین مختلف تمامی عملکردهای سلول، از کپی کردن DNA و تسریع متابولیسم پایه تا تولید حرکت سلولی، را انجام می‌دهند. بنابراین تحلیل پروتئین، اطلاعات مهمی به‌منظور درک فرآیندهای بیولوژیکی و بیماری‌ها در اختیار ما می‌گذارد (کادر 1). در مقایسه با پیشرفت‌های فنی چشمگیر در حوزه‌ی توالی DNA، توسعه‌ی تکنیک‌های بسیار حساس و پربازده توالی‌یابی پروتئین به‌طور جدی عقب مانده است. تنها روش‌های مورد استفاده‌ی فعلی برای توالی پروتئین تخریب گام به گام ادمن، طیف‌سنجی جرمی یا ترکیب این دو روش است (کادر 2).

استاندارد طلایی فعلی برای توالی‌یابی پروتئین، طیف‌سنجی جرمی است. این روش ایرادهایی اساسی از لحاظ محدودیت شناسایی و دامنه‌ی دینامیک دارد. نمونه‌های انسانی بسیار پیچیده و شامل دامنه‌ی گسترده‌ای از تنوع پروتئینی هستند. برای مثال، در پلاسمای انسان، تراکم پروتئین می‌تواند از چند پیکوگرم در میلی‌لیتر (اینترلوکین) تا چند میلی‌گرم در میلی‌لیتر (آلبومین) متفاوت باشد. بنابراین، دامنه‌ی دینامیکی بسیار بالا (109~) برای آنالیز مقایسه‌ای پروتئوم ضروری است. به‌روزترین طیف‌سنجی‌های جرمی محدود به دامنه‌ی دینامیکی 104~ تا 105 هستند. ایراد دیگر این ابزار، محدودیت شناسایی آن است، که مانع کشف بیومارکرها می‌شود و نیاز به مقدار زیادی از نمونه‌ دارد. اگر پروتئینی را در نظر بگیریم که در سلولی با تعداد کپی کم باشد (کمتر از 1000 مولکول در هر سلول) ، بایستی میلیون‌ها سلول به کار گرفته شوند تا محدودیت شناسایی ابزار را فراهم سازند. به همین دلایل طیف سنجی جرمی به عنوان تکنیکی برای آنالیز تک سلول، فاصله‌ی قابل توجهی تا شرایط ایده‌ال دارد.

پیشرفت‌های چشمگیر در فناوری توالی‌یابی DNA که حتی یک مولکولDNA می‌تواند توالی‌یابی شود، برای فناوری‌های نو در زمینه‌ی توالی‌یابی پروتثین الهام‌بخش بوده است. البته به‌دلیل ماهیت پیچیده‌ی پروتئین‌ها، جستجوی چنین روش توالی‌یابی مهم است. پروتئین‌ها از 20 آمینو اسید متفاوت ساخته شده‌اند، درحالیکه DNA تنها از چهار باز ساخته شده است. مستقل از روش انتخابی، شناسایی 20 سیگنال متفاوت بسیار چالش‌برانگیز است. علاوه‌براین، نمونه‌های DNA با تراکم آنالیت پایین را می‌توان با استفاده از پلیمراز تقویت کرد، درحالیکه پلتفرم‌های توالی‌یابی پروتئین از چنین سیستم تکثیری بی‌بهره هستند چراکه هیچ روش تقویتی مانند واکنش زنجیره‌ی پلیمراز برای پروتئین وجود ندارد. روش‌های توالی‌یابی پروتئین که توالی دقیق هر پروتئین را در سطح تک مولکول می‌خوانند، می‌توانند انقلابی برای مطالعه پروتئومیک‌ به ارمغان آورند و حساسیت کافی برای شناسایی پروتئین‌هایی با فراوانی بسیار کم فراهم کنند. . به‌علاوه، چنین روشی در مقایسه با روش‌های فعلی، قابلیت‌های متنوعی به مطالعات پروتئومیکس تک سلولی می‌افزاید.

در این اینجا، ما خلاصه‌ای از شاخه‌های نو و هیجان‌انگیز توالی‌یابی تک مولکول پروتئین را ارائه می‌کنیم. در چند سال گذشته، چندین رویکرد برای توالی پروتئین در سطح تک مولکول ارائه شده است. این ایده‌های نو ادامه‌ی روش‌های تخریب گام به گام ادمن و طیف‌سنجی جرمی هستند تا دستگاه‌های مولکولی جدید را از طریق بازتعریف پلتفرم‌های توالی‌یابی تک مولکول DNA برای توالی‌یابی پروتئین گسترش دهند. روش‌های پیشنهادی بر اساس تکنیک‌های تک مولکولی مانند نانوحفره‌ها، فلوئورسانس و جریان‌های تونلی در نانوگپ‌ها هستند (شکل 1). ما طرح‌هایی که تاکنون پیشنهاد شده‌اند و همچنین مزایا و معایب آن‌ها را توضح می‌دهیم. همچنین اولین تلاش‌های تحقیقاتی و آزمایش‌های اثبات اصول به سوی کاربردی شدنشان را مورد بحث قرار می‌دهیم.

 

انگشت نگاری پروتئین با استفاده از فلوئورسانس

تکنیک‌های فلوئورسانس به‌منظور توسعه‌ی دستگاه‌های توالی‌یابی DNA پربازده حایز اهمیت بوده است. در سیستم‌هایی مانند سیستم‌های ایلومینا، پاسیفیک بیوساینس، و هلیکوس، DNA با استفاده از پایش اتصال نوکلئوتید‌های برچسب‌دار شده با فلوئورسانت، طی فرآیند تکثیر رشته توالی می‌یابد. روش‌های نوپدید توسعه‌ی توالی‌یابی پروتئین برپایه‌ی فلوئورسانس با چالش‌های زیادی روبه‌رو است. از جمله این محدودیت‌های عمده‌ می‌توان به کمبود فلوئورفور آلی برای شناسایی 20 آمینو اسید متفاوت بدون نویز قابل‌توجه، و عدم حضور شرایط شیمیایی مناسب برای برچسب‌گذاری 20 آمینو اسید اشاره کرد.

اخیرا، طرح‌های ساده شده، که در آن تنها یک زیرمجموعه‌ی کوچک از آمینو اسیدها که با استفاده از فلوئورسنت برچسب‌گذاری و شناسایی شده پیشنهاد شده است. این روش‌ها، درصورت اثبات، می‌توانند منجر به توسعه‌ی روش‌های شناسایی پروتئین با حساسیت تک مولکول شوند. این رویکردها به نقشه‌برداری نوری DNA شباهت دارند، که برای شناسایی ویژگی‌های معین ژنوم یا شناسایی پاتوژن‌های مختلف، اطلاعات بخشی از توالی کافی است.

در سال 2015، جو و همکارانش طرح انگشت‌نگاری مبتنی بر شناسایی دو نوع آمینواسید را پیشنهاد دادند. در رویکرد آن‌ها، آمینواسیدهای سیستئین (C) و لیزین (K) پروتئین برچسب‌گذاری شده و متعاقبا شناسایی می‌شوند. سپس می‌توان از توالی سیستئین‌ها و لیزین‌ها (توالی CK) برای شناسایی پروتئین موردنظر با استفاده از پایگاه‌ داده‌ی پروتئین استفاده کرد (شکل 2ب). برای خواندن توالی CK، آنفولدازی[1] به نام ClpX به سطح تک مولکول می‌چسبد و به‌عنوان اسکنر پروتئین عمل می‌کند. این موتور مولکولی، پلی‌پپتیدهای متصل شده را شناسایی می‌کند و در زمان انتقال‌شان از طریق حفره‌ی داخلی‌اش، آن‌ها را واسرشت می‌کند. اگر آنزیم دارای برچسب دهنده‌ی فلوئورفور و سوبسترا شامل یک گیرنده که در سیستئین و لیزین خود رنگ شده، باشند آنگاه اگر هرکدام از این آمینواسیدها به حفره ClpX نزدیک شود، انتقال انرژی رزونانسی فورستر (FRET) اتفاق می‌افتد و توالی CK تولید می‌شود که در یک رشته از سیگنال، دو گیرنده‌‌ی متفاوت خوانده می‌شود (شکل 2الف).

امکان سنجی رویکرد انگشت‌نگاری CK، به‌صورت محاسباتی و با استفاده از پایگاه‌ داده‌ی پروتئین انسانی که شامل تقریبا 20000 مدخل پروتئین بود، مورد ارزیابی قرار گرفت. توالی CK نیز به‌صورت محاسباتی تولید شد و رایج‌ترین خطاهایی که در طول خواندن آزمایش‌ها انتظار می‌رفت نیز درنظر گرفته شد. این توالی‌های CK تولید شده با پایگاه داد مقایسه شدند و احتمال بازیابی توالی اصلی بر اساس دقت تطابق‌ها محاسبه شد. با درنظر گرفتن 10% سطح خطا در خواندن، تقریبا نیمی از توالی‌های پروتئین به درستی بازیابی می‌شوند. با درنظر گرفتن پارامترهای اضافی، از جمله فاصله میان سیستئین و لیزین، با استفاده از این روش می‌توان درصد عمده‌ی (بیش از 70-80 %) پروتئین‌ها را حتی با احتساب نرخ خطا (20-30 %) به‌طور دقیق تشخیص داد (شکل 2ج).

جو و همکارانش امسال اثبات ایده‌ای را به‌طور آزمایشگاهی شرح دادند. ایشان با استفاده از ClpP با برچسب بخشنده (محفظه‌ای پروتئین کافت که ClpX را متصل می‌کند) به‌طور متوالی سیگنال‌های FRET ساتع شده از سوبستراهایی با برچسب گیرنده را می‌خوانند. آن‌ها می‌توانند آمینو اسیدهای -29، -40، -51 پپتیدهای بلند، یک مونومریک (119 آمینو اسید) و یک دیمریک (210 آمینو اسید) را انگشت‌نگاری کنند. ClpXP که مجدد و متفاوت هدف‌گذاری شده، سرعت انتقال ثابت و تک‌جهت‌گیری را از خود نشان داد که ویژگی‌هایی مناسب برای انگشت‌نگاری قابل اعتماد هستند. توجه داشته باشید که سیستم انگشت‌نگاری مشابهی پیشنهاد و به‌طور آزمایشگاهی با استفاده از ریبوزوم برچسب‌گذاری شده نشان داده شد تا تولید پروتئین‌های خاص درون سلول را طوری پایش کند تا اطلاعاتی درباره‌ی مکان و سطح بیان پروتئین به دست آورد.

مارکوت و همکارانش روش متفاوتی در پیش گرفتند که در آن انگشت‌نگاری پپتید با استفاده از ورژن تک مولکولی تخریب گام به گام ادمن صورت می‌گیرد. برخلاف تخریب گام به گام سنتی ادمن، شناسایی تک مولکولی تحلیل جمعیت‌های مخلوط را ممکن می‌سازد. در این رویکرد، پروتئین‌ها به تکه‌های پپتیدی خرد می‌شوند (به بلندی حدودا 10-30 آمینو اسید) و آمینو اسیدهای خاص با فلوئورفورهایی با رنگ‌های قابل تشخیص برچسب‌گذاری می‌شوند. پپتیدهای برچسب‌دار شده به سطح می‌چسبند و میکروسکوپ فلوئورسانس برای پایش هر چرخه‌ی تخریب ادمن در تفکیک تک مولکولی مورد استفاده قرار می‌گیرد (شکل 2د). هر چرخه‌ی تخریب، آمینو اسیدهای پایانه آمینی پپتید را حذف می‌کنند‌، به‌طوری که توالی آمینو اسیدهای برچسب‌گذاری شده از طریق پایش تغییرات شدت فلوئورسانس در هر چرخه شناسایی شوند. کاهش فلوئورسانس پس چرخه‌ی تخریب نشان می‌دهد آمینو اسیدهای برچسب‌گذاری شده شکسته شده است. آمینو اسیدهای شکسته شده با استفاده از اطلاعات طیفی قابل شناسایی هستند (شکل 2هـ).

شبیه‌سازی رایانه‌ای به‌منظور بررسی احتمال پیداکردن پروتئین از شناسایی یک توالی پپتید منحصربفرد با استفاده از روش انگشت‌نگاری کارکوت مورد استفاده قرار گرفته است. روش‌های تثبیت متفاوت، برچسب‌گذاری و تقسیم ارزیابی شدند، و مشخص شد حداقل چهار آمینواسید برچسب‌گذاری شده‌ی متفاوت برای شناسایی 98% پروتوم انسانی لازم است.

نقشه‌های انگشت‌نگاری که در اینجا پیشنهاد شده، از این حقیقت که پروتئین‌ها را می‌توان با استفاده از اطلاعات توالی ناقص شناسایی کرد، بهره می‌برد. رویکرد پیشنهادی جو و همکارانش پروتئین‌‌های کامل را می‌خواند وبه این ترتیب به برچسب‌گذاری‌های ساده و دو رنگ سوبستراها نیاز دارد. محدودیت اصلی الزام برچسب شناسایی در پایانه‌ی C و N سوبسترا به‌منظور شناسایی واسرشتگی است. به نظر می‌رسد ترسیم نقشه‌های الحاق به‌منظور افزودن چنین برچسبی به تمام پروتئین‌ها در مخلوط یا مهندسی آنزیمی که شناسایی هر پروتئینی که از آماده‌سازی سلولی و دیگر نمونه‌های بیولوژیکی به دست آید را ممکن می‌سازد امکان‌پذیر است. رویکرد مارکوت برای انگشت‌نگاری از رویکردی به‌کل شیمیایی بهره می‌گیرد، که برای اهداف تجاری‌سازی سودمند است. البته شرایط سخت لازم برای واکنش ادمن نیاز به انتخاب دقیق فلوئورفور و مجموعه‌ای تطبیق برای میکروسکوپ سنتی (TIRFM) دارد. یکی از معایب این روش آن است که هر چرخه‌ی تخریب ادمن تقریبا 45 دقیقه طول می‌کشد و باعث می‌شود فرایند توالی بسیار کند شود. رویکرد جایگزین برای تخریب ادمن درحال بررسی است، در این رویکرد آنزیمی طراحی می‌شود که می‌تواند آمینواسیدها را، دانه دانه، از پایانه‌ی N پروتئین جدا کند. استفاده از این آنزیم، به نام ادمناز[2]، به تخریب ادمن اجازه می‌دهد تا تحت شرایط فیزیولوژیکی و با سرعت بیشتری ادامه یابد.

انگشت‌نگاری فلوئورسانس نقش مهمی در پیشرفت فناوری‌های سریع برای شناسایی و آنالیز موازی پروتئین ایفا می‌کند. میلیون‌ها و هزاران میلیون تک مولکول را می‌توان همزمان تثبیت و پایش کرد که این امر دری به سوی آزمایشات پربازده باز می‌کند. شناسایی تک مولکول پروتئین با استفاده از فلوئورسانس می‌تواند مکمل روش‌های نوپدید توالی‌یابی پروتئین باشد، و حساسیت روش‌های فعلی شناسایی مواد حجیم از جمله شناسایی پروتئین میکروآرایه آنتی‌بادی یا طیف‌سنجی جرمی مبتنی بر انگشت‌نگاری پروتئین را بهبود بخشد. حساسیت بهبود یافته‌ی این روش‌ها برای کاربردهایی از جمله شناسایی بیومارکرها برای تشخیص بیماری حایز اهمیت است.

 

توالی پروتئین با استفاده از جریان‌های تونلی

ایده‌ی استفاده از جریان‌های تونلی برای سنجش تک مولکول‌ها برای اولین‌بار در سال 1970 مطرح شد. جریان‌های تونلی میان دو الکترود فلزی که با استفاده از شکافی، در محدوده‌ی چند آنگستروم تا چند نانومتر از هم جداشده‌اند، سنجیده می‌شوند (شکل 3الف، د). زمیانیکه یک مولکول از شکاف نانومقیاس عبور می‌کند، تغییر جریان تونلی اندازه‌گیری می‌شود. این مدولاسیون جریان برای تعیین اینکه کدام مولکول در لحظه و بلادرنگ در شکاف حضور دارد مورد استفاده قرار می‌گیرد. با اختراع میکروسکوپ تونلی روبشی در دهه‌ی 1980، تحقق این ایده امکان‌پذیرتر و منجر به توسعه‌ی شاخه‌ای جدید به نام الکترونیک مولکولی شد. در سال‌های اخیر، این روش پیشرفت کرد و به مطالعه‌ی انواع بیومولکول‌ها با هدف توالی‌یابی DNA و RNA انجامید. مشابهاً، علاقه به مطالعه‌ی آمینواسیدها و پپتیدها با انگیزه‌ی توالی‌یابی پروتئین بیشتر شد. در این بخش، ما خلاصه‌ای از این پیشرفت‌ها را ارائه می‌کنیم.

در سال 2014، لیندسِی و همکارانش اولین سنجش آمینواسیدها و پپتید‌های کوتاه با استفاده از جریان‌های تونلی را گزارش کردند. آن‌ها با تحلیل سه دسته از آمینواسیدها با تفاوت ساختاری جزئی، گلیسین در مقابل صورت متیل‌دار سارکوزین، آنانتیومر آسپاراژین (آسپاراژین-L در مقابل آسپاراژین-D) و لوسین ایزوبار در مقابل ایزولوسین، حساسیت رویکردشان را نشان دادند. آزمایش تجربی آن‌ها شامل دو الکترود پالادیوم بود که با شکاف 2 نانومتری از هم جدا می‌شدند. الکترودها با دو مولکول شناساگر[3] متصل شده با پیوند کووالانسی عامل دار می‌شدند. مولکول شناساگر به‌طور موقت با آنالیت واکنش می‌داد تا مولکول‌ را جهت‌دهی کند و مسیر جریان بهتری آماده کند (شکل 3الف). برای معرفی هر آمینو اسید به سیستم، واکنش‌های موقت میان هر آمینو اسید و مولکول شناسایی به‌صورت رشته‌ای از پیک‌های جریان مشخص ‌شد (شکل 3ب). با استفاده از نقشه‌ای دوبعدی از دامنه‌ی جریان و شکل پیک‌ها، آمینو اسیدهای آنالیز شده در هر دسته با دقت 80% یا بالاتر مشخص می‌شدند.

کاوای و همکارانش نیز پس از آن پژوهشی انجام دادند که تمامی 20 آمینو اسید و فسفوتایروزین‌ها را با استفاده از جریان‌های تونلی تحت شرایط متفاوت آزمایشگاهی آزمایش کردند. در این پژوهش، با استفاده از بریک جانکشن طلا شکاف‌هایی کمتر از 0.70 نانومتر و 0.55 نانومتر ایجاد کردند. اندازه‌ی کوچک شکاف شناسایی آمینو اسیدها را بدون مولکول شناسایی ممکن می‌سازد (شکل 3د). شکاف‌های 0.70 نانومتری برای هشت آمینو اسید (Y، F، W، H، P، E، D، I) از 20 آمینو اسید سیگنال‌های قابل شناسایی تولید کرد، درحالیکه شکاف‌های کوچک‌تر از 0.55 نانومتری برای 9 آمینو اسید (P، H، E، D، I، K، C، L، M) سیگنال تولید کرد. درکل، 12 آمینو اسید از 20 آمینو اسید قابل شناسایی هستند؛ بقیه‌ی آمینو اسیدها سیگنال قابل شناسایی تولید نکردند. وقتی یکی از آمینو اسیدهای قابل شناسایی در آزمایش سنجش معرفی شد، در اثر جریان پیک‌هایی مشاهده شد که نشان دهنده‌ی حضور موقت هر مولکول بین الکترودها بود (شکل 3هـ). برای مشخصه‌یابی هر آمینو اسید همان‌طور که در نمودار پراکندگی (شکل 3ی) نشان داده شده، دامنه و مدت زمان هر پیک مورد استفاده قرار گرفت. هفت آمینو اسید سیگنال‌های متفاوتی از خود ساتع کردند و برای تمایز یافتن در مخلوط‌های پیچیده پتانسیل نشان دادند، پنج آمینو اسید دیگر سیگنال‌های غیرقابل تشخیصی تولید کردند. شناسایی اصلاح پساترجمه نیز با استفاده از شکاف‌های 0.70 نانومتری نشان داده شد. تایروزین و فسفوتایروزین سیگنال‌های متفاوتی ساتع کردند و مخلوط آن‌ها در هیستوگرام دامنه دو جمعیت تولید می‌کند. به‌عنوان آخرین نکته، با استفاده از همین رویکرد، پپتیدهای کوتاه شامل تایروزین و فوسفوتایروزین قابل تشخیص هستند.

رویکرد شناسایی تونلی که لیندسی و همکارانش استفاده کردند، حساسیت قابل توجهی مبتنی بر جریان تونل‌زنی کوانتومی از خود نشان داد. این روش می‌تواند ایزومرها و مولکول‌ها با تفاوت ساختاری جزئی را که با دیگر روش‌ها مانند طیف‌سنجی جرمی غیر قابل تشخیص‌اند، از یک دیگر تمایز دهد. از معایب این روش می‌توان به پیچیدگی قابل ملاحظه‌ی داده‌ها اشاره کرد. هر مولکول می‌تواند در نقطه‌ی اتصال جهت‌های متفاوتی بگیرد و تغییرات ترجمه‌ای و دورانی مهمی از خود نشان دهد که به سیگنال‌های جریان متفاوتی می‌انجامد. بنابراین با توجه به ترکیب‌های چندگانه که ممکن است مشاهده شود، الگوریتم‌های یادگیری ماشین برای تشخیص هر مولکول الزامی است.

پژوهش کاوای و همکارانش مشخصه‌یابی سیستماتیکی از آمینو اسید‌ها و پپتیدهای کوتاه متفاوت نشان می‌دهد. از 20 آمینو اسید بررسی شده، 7 آمینو اسید سیگنال‌های قابل تشخیص تولید کردند. این امر نشان‌ دهنده‌ی گام امیدبخشی به سمت تشخیص تفاوت آمینو اسید برای توالی‌یابی پروتئین است. آرایه‌هایی که شامل نقاط اتصال با اندازه‌های متفاوتند، ممکن است تعداد آمینو اسیدهای قابل شناسایی را افزایش دهد و احتمال تشخیص آمینو اسیدها در مخلوط را بالا ببرد. بهبودهای فنی در آزمایش‌های تجربی و فرآیندهای خاص این کار را آسان می‌کند. برای مثال، اخیرا نشان داده شده که پوشش بیشتر روی نانوالکترودها باعث بهبودهایی در نسبت سینگال به نویز و پهنای باند اندازه‌گیری‌ها می‌شود.

برای تبدیل این اثبات مفهوم به ابزار توالی، اندازه‌گیری جریان‌های تونلی بایستی با سازوکار‌هایی ترکیب شود که پلی‌پپتیدها را به‌صورت آمینو اسید به آمینو اسید و کنترل شده در جایگاه تولید سیگنال (شکاف) قرار دهد. اگزوپپتیداز یا موتور مولکولی دیگر می‌تواند برای انتقال پلی‌پپتید در چنین شکاف الکترودی تغییر پیدا کنند. اگر دستگاه تونل‌زنی با نانوحفره ترکیب شود، الکتروفورز، اسمز الکتریکی یا یا تفاوت فشار نیز می‌توانند به‌عنوان سازوکار کنترل برای مولکول‌ها مورد استفاده قرار گیرند. چندین گروه اولین تلاش‌های آزمایشگاهی خود در این زمینه را گزارش کرده‌اند.

 

توالی پروتئین با استفاده از نانوحفره‌ها

در سال 2014، سازمان فناوری‌های مبتنی بر نانوحفره‌های آکسفورد خبر انتشار اولین دستگاه توالی DNA تک مولکولی مبتنی بر نانوحفره‌ها را اعلام کرد. این دستگاه‌های جیبی با امکان خواندن بسیار طولانی و در شناسایی آزمایشگاهی در لابراتوارهای دور (حتی در فضای بیرونی) انقلابی در توالی‌یابی DNA به ارمغان آورد. در آزمایش نانوحفره، غشاء عایق شامل حفره‌ای نانومتری میان دو قسمت پرشده با الکترولیت است. وقتی ولتاژی در غشاء اعمال می‌شود، جریان یونی درون نانوحفره جریان می‌یابد. همان‌طور که مولکول‌ها تک تک به حفره منتقل می‌شوند، مدولاسیونی در جریان‌های یونی مشاهده می‌شود که اطلاعات ساختاری درباره‌ی مولکول مورد نظر ارائه می‌دهد. با استفاده از این اصل، بیوپلیمرها چنان توالی می‌یابند که هر قسمت از زنجیره در انقباض نانوحفره به‌صورت عرضی توالی ‌یابد.

پتانسیل نانوحفره‌ها برای توالی DNA اثبات شده است. استفاده از نانوحفره‌ها برالی توالی تک مولکول پروتئین‌ها مرز بعدی است. این کار به هیچ وجه ساده نیست، چراکه برای توالی‌یابی پروتئین با استفاده از نانوحفره‌ها بایستی از پس چالش‌های بزرگی بربیاییم. اول اینکه، برخلاف DNA که ضرورتاً توزیع بار یکنواختی دارد، ساختار آمینو اسیدها توزیع بار بسیار متنوعی دارد. بنابراین انتقال تک‌جهت پلی‌پپتیدها به‌وسیله‌ی اعمال الکتروفورز در نانوحفره‌ها به آسانی قابل اجرا نیست. دوم، بیشتر پروتئین‌ها در حالت پایه‌شان پیچ خورده‌اند. اختلال در ساختار دوم و سوم آن‌ها برای عبور از نانوحفره ضروری است. سوم، توالی پروتئین نیازمند تمایز 20 آمینو اسید متفاوت، با اندازه‌ای پنج برابر بزرگتر از توالی DNA با چهار باز است.

برای اولین انتقال در نانوحفره از پلی‌پپتیدهایی استفاده شد که تنها 20 تا 30 آمینو اسید داشتند. پپتیدهای کوتاه ساختار سوم ندارند و بدون نیاز به عوامل تغییر ساختار، قابل انتقال هستند. در این پژوهش‌ها، پپتیدهایی که شامل موتیف‌هایی مانند ساختار روبانی بتا[4]، مارپیچ آلفا[5] یا مارپیچ‌های کلاژن مانند، با استفاده از آلفا همولیزین و نانوحفره‌های آیرولیزین آنالیز شدند. این پژوهش جنبه‌های مهم سینتیک و انتقال پلی‌پپتید را توضیح داد و بر نقش کلیدی واکنش‌های پپتید و نانوحفره در زمان عبور موکلول تأکید کرد. کار دقیق بِیلِی و همکارانش در زمینه‌ی پپتید مارپیچی شامل توالی (AAKAA) n درک مهمی از فرآیند به دام انداختن پروتئین و جزء‌بندی به نانوحفره‌ها برای ما فراهم کرد.

درحالیکه انتقال پپتیدها هنوز هم مدل ارزشمندی برای فهمیدن گام‌های پایه‌ای فرآیند پیچیده‌ی انتقال پروتئین است، هدف نهایی توالی‌یاب پروتئین مبتنی بر نانوحفره، خواندن تمام پروتئین‌ها است و به تغییر ماهیت پروتئین نیاز دارد. روش‌های شیمیایی و فیزیکی برای واسرشتگی پروتئین در تحلیل نانوحفره پیشنهاد شده است. چندین گروه با استفاده از تغییرات ساختاری شدید از جمله اوره، سولفات لاریل سدیم (SDS) یا گوآنیدینیوم کلرید (GdnHCl)، واسرشتگی و انتقال پروتئین‌ها در نانوحفره‌های جامد را با موفقیت به انجام رساندند. عبور دادن پروتئین‌ها از درون نانوحفره‌های بیولوژیکی با استفاده از آنفولداز نیز انجام شده است. در این مورد، نانوحفره‌های حالت جامد نسبت به نانوحفره‌های بیولوژیکی مزیتی دارند، آن هم اینکه نانوحفره‌های حالت جامد در شرایط به شدت بافری پایداری بیشتری از خود نشان می‌دهند (8 مولار اوره، 6 مولار GdnHCl یا 1% SDS)

کانال‌های بیولوژیکی نسبت به دستگاه‌های حالت جامد به شرایط تغییر ساختار حساس‌تر هستند اما می‌توانند به‌طور قابل توجهی تا غلظت‌ 4 مولار اوره و 1.5 مولار GdnHCl را تاب بیاورند. این غلظت‌ها برای شکستن ساختار بعضی از سوبستراهای پروتئینی کافی است و انتقال را ممکن می‌سازد. برای مثال، پژوهشی پیش از این (شکل 4 الف، ب) که برای اولین بار واسرشتگی و انتقال پروتئین را در آلفا همولیزین نشان داد، با استفاده از پروتئین متصل به مالتوز انجام شد که موجب واسرشتگی در غلظت‌هایی پایین‌تر از قبل (0.8 مولار GdnHCl) می‌شوند.

روش‌های فیزیکی از جمله دمای بالا برای واسرشتن پروتئین‌ها در هردو نانوحفره‌ی حالت جامد و بیولوژیکی مورد استفاده قرار گرفته‌اند. پِلتا و همکارانش واسرشتگی دمایی پروتئین‌های متصل به مالتوز با گستره‌ی دمایی 20 تا 70 درجه سانتی‌گراد در هر دو نانوحفره‌ی آلفا همولیزین و آیرولیزین را بررسی کردند. گرما، واسرشتگی پروتئین را آسان می‌کند اما دینامیک‌های انتقال را تسریع و توالی‌یابی را چالش‌برانگیز می‌کند. مشابها دو گروه پژوهشی نشان دادند که ولتاژ بالا به پروتئین کمک می‌کند تا در زمان حرکت در نانوحفره‌های حالت جامد کش بیاید. این رویکردها به دلیل الکتروپوراسیون لیپیدهای دولایه در ولتاژ بالا (حدود 0.4 ولت) ، با نانوحفره‌های بیولوژیکی سازگار نیستند؛ همچنین این رویکردها سرعت انتقال را افزایش می‌دهند.

مانع اصلی توسعه‌ی توالی‌یاب پروتئین با استفاده از نانوحفره، توزیع بار غیر یکنواخت ساختارهای آمینو اسیدی است. برخلاف DNA که توزیع بار یکنواختی دارد و با نیروی الکتروفورز در نانوحفره حرکت می‌کند، پروتئین‌ها بار محلی متفاوتی حمل می‌کنند. به‌علاوه مشخص نیست که نیروهای الکتروفورز و الکترواسمز از پس انتقال پروتئین بربیایند (مگر اینکه به واسطه‌ی یون‌های سطح نانوحفره نیروی الکترواسمز اعمال شود). یکی از راه‌حل‌های این مسئله استفاده از SDS به‌عنوان عامل واسرشتگی است. SDS نه تنها پروتئین‌ها را واسرشته می‌کند، بلکه آن‌ها را با باری منفی که گروه‌های سولفاتی، ترکیب اصلی شوینده، ایجاد می‌کنند، می‌پوشاند. SDS پروتئین‌ها را در حفره‌هایی با قطر زیرنانومتری هل می‌دهد و پتانسیل استفاده از نانوحفره برای تمایز آمینو اسیدهای متفاوت را نشان می‌دهد (شکل 4ج). درک کامل‌تر تأثیر SDS در واسرشتگی و انتقال پروتئین‌ را گروه ما ارائه کرد. آزمایش‌ها نشان دادند SDS، پروتئین‌هایی که به‌صورت پایدار پیچ خورده‌اند از جمله تیتین و بتا آمیلاز را واسرشته می‌کند (شکل 4د). به‌علاوه، مسیر ثابت انتقال به دلیل بار منفی که SDS حمل می‌کند، با نیروی الکتروفورز تحریک می‌شود.

رویکرد جایگزین برای کنترل مسیر انتقال، اتصال رشته‌ی الیگونوکلئوتید به پایانه‌ی N یا C پروتئین است. بار منفی حمل شده به‌وسیله‌ی این توالی پیشرو، پلی‌پپتیدها را در مسیر نیروی الکتروفورز می‌کشاند. اولین بار بِیلِی و همکارانش به‌منظور مطالعه‌ی عبور تیوردوکسین درون آلفا همولیزین از این اصل استفاده کردند. در پژوهش آن‌ها، الیگونوکلئوتید 30 پاری به پایانه‌ی C پروتئین متصل شد، و بر پایه‌ی افزودن سوبسترا به قسمت سیس (cis)، الگویی تکراری با چند سطح جریان مشاهده شد که با برچسب DNA به دام افتاده، واسرشتگی محلی پایانه‌ی C و واسرشتگی باقی‌مانده‌ی پروتئین مطابق بود (شکل 5الف). واسطه‌ای که تنها قسمتی از آن واسرشته شده بود و پایانه‌ی C پروتئین در آن از طریق انقباض نانوحفره به‌صورت محلی واسرشته شده بود، بعدا برای تمایز میان پروتئین‌های فسفریله نشده، تک فسفریله شده و دو فسفریله شده مورد استفاده قرار گرفت. دیگر گروه‌ها نیز اخیرا از این رویکرد استفاده کردند. لیندسِی و همکارانش به‌منظور آسان‌سازی واکنش‌های برچسب‌گذاری، شیمی کلیکی[6] ساده و اثرگذار توسعه دادند، این در حالیست که پلتا و همکارانش برای ارائه‌ی اثباتی مستقیم از انتقال پروتئین با استفاده از تکثیر به وسیله‌ی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، از پیشروی DNA در آن استفاده کردند.

در تمام مطالعاتی که تاکنون انجام شده، انتقال پروتئین‌ها در مقیاس زمانی سریع‌تر از یک میلی ثانیه اتفاق می‌افتد که برای هدف توالی‌یابی بسیار سریع است. در واقع، انتقال تک پروتئین ماهیتا بسیار سریع اتفاق می‌افتد. کنترل سرعت انتقال به‌منظور تضمین زمان کافی برای خواندن دقیق آمینو اسیدهای متفاوت به‌وسیله‌ی نانوحفره امری ضروری است.

حرکت کنترل شده و یک جهت DNA درون نانوحفره با استفاده از هلیکازها و پلیمرازها موفقیت چشمگیری در توسعه‌ی توالی‌ یاب‌ DNA مبتنی بر نانوحفره بود. آکسون و همکارانش رویکرد مشابهی برای پروتئین‌ها پیشنهاد دادند. در پژوهش‌ آن‌ها، یک موتور آنزیمی، ClpX، زنچیره‌ی پلی‌پپتید را واسرشت می‌کند و آن‌ها را به‌صورت کنترل شده درون آلفا همولیزین می‌کشد. ClpX پروتئین‌ها را با اندازه‎‌ی گام حرکت معین و سرعتی کم و کافی برای توالی‌یابی انتقال می‌دهد (80 آمینو اسید بر ثانیه) ، و نیرویی تولید می‌کند که برای واسرشتن پروتئین‌ها به اندازه‌ی کافی قوی (تقریبا 20 پیکونیوتن) است. در نقشه‌ی آزمایشگاهی آن‌ها (شکل 5ب) لیپیدی دولایه شامل آلفا همولیزین، دو قسمت را از هم جدا می‌کند. سمت سیس شامل پروتئینی به نام Smt3 است که با آمینو اسید-65 با افزونه‌ی بار منفی و برچسب ssrA اصلاح شده است. برچسب ssrA برای شناسایی ClpX ضروری است و افزونه‌ی آمینو اسید-65 به‌عنوان لنگری به کار می‌رود که پروتئین‌ها را جهت دهی می‌کند و اجازه می‌دهد برچسب ssrA در معرض سمت انتقال قرار بگیرد که ClpX اضافه می‌شود. ردیابی زمان فرآیند، به دام‌اندازی سوبسترا و انتقال به‌وسیله‌ی ClpX را نشان می‌دهد. در پژوهشی تکمیلی الگوریتم یادگیری ماشین با سه پارامتر (زمان اسکان، میانگین دامنه جریان و انحراف معیار دامنه‌ی جریان) برای تمایز میان حوزه‌ها و انواع دیگر آن حوزه‌ها از جمله جهش و قطع مورد استفاده قرار گرفت.

این رویکرد دو الزام مهم در توالی‌یابی پروتئین مبتنی بر نانوحفره‌ها را رفع کرد: واسرشتگی پروتئین و انتقال کنترل شده‌ی سوبسترا. بزرگترین مشکل این روش نیاز آن به اضافه کردن افزونه‌ی پلی‌پپتید به سوبسترا است. هرچند این مشکل با اتصال شیمیایی پلی‌پپتید به پایانه‌ی N پروتئین قابل حل است. همچنین نویز زیاد در سیگنال نیاز به اصلاح دارد. رویکردهای دیگری نیز پیشنهاد شده، اما اثبات آزمایشگاهی ندارد. استفاده از سیستم دو حفره‌ای که در آن دو نانو حفره پشت سر هم قرار گرفتند نیز پیشنهاد شده است. چنانکه پلی‌پپتید در عرض اولین حفره قرار گیرد، اگزوپپتیدازی آن ‌را می‌شکند و آمینو اسیدهای آزاد شده به‌وسیله‌ی آنزیم را دومین حفره آنالیز می‌کند. استفاده از نانوکانال‌های عمود برهم که در آن پروتئین در جهت طولی کشیده می‌شود و جریان یونی به‌صورت عرضی ثبت می‌شوند، نیز پیشنهاد شده است و برای کنترل انتقال پلی‌پپتید از گرافن استفاده می‌کند. گرافن و دیگر مواد دو بعدی به‌عنوان غشاء نانوحفره‌ها مورد توجه قرار گرفته‌اند چراکه به‌طور خودکار نازک هستند بنابراین رزولوشن لازم برای شناسایی آمینو اسیدها را به‌صورت تک تک بهبود می‌بخشد. استفاده از شبیه‌سازی دینامیک مولکولی نشان داد که پروتئین‌ها و پپتیدها به‌وسیله‌ی جذب سطحی آمینو اسیدها روی غشاء گرافن سقوط می‌کنند و منجر به حرکت آرام و گام به گام آمینو اسیدها به درون نانوحفره می‌شود.

همچنین به‌منظور بهبود طیف‌سنجی جرمی، تلاش قابل ‌توجهی برای بازتعریف نانوحفره‌ها انجام شده است. طرح استفاده از نانوحفره‌های حالت جامد برای ساخت نسخه جدید طیف‌سنج جرمی که در آن یونیزاسیون الکترواسپری به‌وسیله‌ی نازل‌های میکرومتری انجام می‌شود، از نانوحفره‌ی پیشنهاد شده آغاز می‌شود. این امر اجازه می‌دهد پروتئین‌هایی که قسمت قسمت هستند، در زمان عبور از نانوحفره توالی یابند و آمینو اسیدها تک به تک و پشت سر هم یونیزه و شناسایی شوند. برای شرح جزئیات تلاش‌ها در جهت بهبود حساسیت طیف‌سنجی جرمی، به خلاصه‌های دیگر مراجعه می‌کنیم.

به‌طور خلاصه، با استفاده از رویکرد نانوحفره در زمینه‌ی توالی‌یابی پپتیدها و پروتئین‌ها پیشرفت‌های بزرگی حاصل شده است. این شاخه‌ بسیار فعالانه مورد مطالعه قرار گرفته و به همین دلیل پیشرفت‌های مهمی در جهت توسعه‌ی توالی یاب پروتئین در سال‌های آتی پیش بینی می‌شود. یکی از مزایای نانوحفره در این زمینه امکان خواندن طولانی است. روش‌های سنتی توالی‌یابی از جمله تخریب ادمن و طیف‌سنجی جرمی بر پایه‌ی تقسیم پروتئین‌ها به پپتیدهای کوتاه است، اما دستگاه‌های نانوحفره توالی‌یابی پروتئین کامل را ممکن می‌سازد. چالش اصلی کنترل سرعت انتقال پلی‌پپتیدها است. در حال حاضر رویکردهای متفاوتی در دست بررسی است و احتمال می‌رود مانند مورد توالی‌یابی DNA، انتقال‌هایی به کمک آنزیم این گام را جلو ببرند. بررسی استخری از آنفولداز فراتر از ClpX گام مهمی برای تحقق این هدف است.

 

چشم انداز

پروژه‌ی ژنوم انسان سال‌های هیجان انگیز مطالعات ژنومی را آغاز کرد. در سالهای پیشِ رو شاهد پیشرفت‌ مهمی در دیگر ئومیک‌ها[7]، به ویژه پروتئومیک خواهیم بود. در این حوزه، توسعه‌ی رویکردهای تک مولکولی کلید دست یافتن به حساسیت و گستره‌ی دینامیک مورد نیاز برای تحلیل پروتئین‌ها است. تلاش‌ها در شاخه‌های فلوئورسانس تک مولکول، جریان‌های تونلی و نانوحفره‌ها ادامه دارد. در این مجال، ما رویکردهای کلیدی که تاکنون برای توالی‌یابی تک مولکول پروتئین پیشنهاد شده‌اند را همراه با نقاط قوت و محدودیت‌هایشان ارائه کردیم. در جدول1 خلاصه‌ای از طرح‌های متفاوت ارائه شده، همراه با در نظر گرفتن معیارهای مرتبط برای توسعه‌ی توالی یاب پروتئین، از جمله مدت زمان خواندن و احتمال اجرای توالی‌یابی جدید را ارائه کردیم.

ما پیش بینی می‌کنیم اولین سیستم‌های شناسایی تک مولکول پروتئین در پنج سال آینده ساخته شود. به احتمال زیاد اولین سیستم‌ها بر اساس طرح انگشت‌نگاری از جمله طرح‌های پیشنهادی مارکوت و همکارانش و جوو و همکارانش باشند. مزیت رویکرد مارکوت تکیه‌ی کامل آن بر واکنش‌های شیمیایی است که می‌توانند منجر به ساخت دستگاهی قوی برای آنالیز آزمایشگاهی شوند. از معایب اصلی این روش می‌توان به سرعت پایین و توانایی تحلیل پپتیدهای کوتاه اشاره کرد. در عوض رویکرد جوو و همکارانش می‌تواند برای تحلیل پروتئین‌های کامل مورد استفاده قرار گیرد اما مشکل آن است که برای شناسایی سوبسترا، مهندسی آنفولداز و پیش­پردازش سوبسترا از جمله الزامات این رویکرد است. هر دو روش بایستی از پس چالش خواندن چندین فلوئورفور با کمترین خطا بربیایند.

پژوهش‌های نانوحفره در مسیر تحلیل و توالی‌یابی پروتئین به سرعت در حال رشد هستند. توالی یاب پروتئین مبتنی بر نانوحفره پتانسیل تجاری شدن در دهه آینده را دارد. چالش‌های اصلی در زمینه‌ی عبور کنترل شده‌ی پروتئین درون نانوحفره و خواندن آن است. رویکرد اکسون با استفاده از آنزیم ClpX برای عبور پلی‌پپتید درون نانوحفره‌ی آلفا همولیزین، در حال حاضر تنها سیستمی است که پروتئین را به‌صورت کنترل شده واسرشته می‌کند و از نانوحفره عبور می‌دهد. اما نویز زیاد در سیگنال‌های مشاهده شده، از شناسایی آمینو اسیدهای خاص جلوگیری می‌کند. برای مشخص کردن تفاوت با توالی‌یابی DNA با رزولوشن بالا، طرح‌های پیکربندی جایگزین و آنزیم‌های احتمالا متفاوت بایستی بررسی شوند.

سوالی که می‌ماند این است که آیا اندازه‌گیری جریان‌های یونی، رزولوشن کافی برای شناسایی 20 آمینو اسید با استفاده از نانوحفره در اختیار ما می‌گذارد یا خیر؟ نتایج آزمایش‌های لیندسِی و کاوای نشان می‌دهد که جریان‌های تونل‌زنی بسیار حساس هستند و می‌توانند مولکول‌هایی با کوچکترین تفاوت ساختاری را از هم تمایز دهند. بنابراین ترکیب سیستم نانوحفره برای انتقال کنترل شده با سنجش حساس جریان‌های تونل‌زنی چاره‌ای قابل توجه به حساب می‌آید که به‌طور بالقوه توالی‌یابی تک مولکول پروتئین را ممکن می‌سازد.

هدف اصلی توالی یاب تک مولکول پروتئین توسعه‌ی ابزاری برای تحلیل تک سلول است. تلاش‌های فعلی برای پروتئومیک‌های تک سلول، از جمله سایتومتری جرمی بر پایه‌ی آنتی‌بادی‌های برچسب‌گذاری شده هستند. دسترسی کم به آنتی‎بادی‌های بسیار خاص و برچسب‌های قابل تشخیص این روش‌ها را برای شناسایی 10 الی 40 پروتئین به ازای هر سلول، که بخش کوچکی از پروتئوم سلول است، محدود می‌کند. روش‌های شناسایی تک مولکول به چنین گام آماده‌سازی نیاز ندارند و می‌توانند، به‌صورت تئوری، هزاران پروتئین از یک سلول را شناسایی کنند. جنبه‌ی مهمی که بایستی به آن پرداخته شود، دستکاری و استخراج پروتئین از تک سلول‌ها بدون هیچ‌گونه تلفات و حذف است. پیشرفت‌های اخیر در حوزه‌ی دستگاه‌های میکروفلوئیدی که پروتئین‌ها از تک سلول‌ها خارج می‌شوند و بر روی تراشه‌ای برچسب‌گذاری می‌شوند اولین گام به سوی این هدف را نشان می‌دهد.

تحقق رویای توالی یاب تک مولکول پروتئین از نظر فنی بسیار چالش‌برانگیز است. هرچند، اگر این هدف محقق شود با تسهیل شناسایی پروتئین‌ها با فراوانی کم و دستیابی به پروتئومیک‌های تک سلول واقعی، در پژوهش‌های پروتئومیک، انقلابی برپا می‌شود. پروتئین‌ها با فراوانی کم برای پژوهش‌های زیست پزشکی ضروری هستند چراکه شناسایی بیومارکرهای اختصاصی بیماری را ممکن می‌سازند. علاوه‌براین، حساسیت شناساگر تک مولکول دسترسی به پروتئوم تاریک[8] انسان را امکان‌پذیر می‌کند. پروتئوم تاریک شامل تقریبا 3000 پروتئین انسانی است که برخلاف شواهد مبنی بر وجودشان در ژنتیک و اطلاعات رونویسی، هیچوقت مستقیما شناسایی نشده‌اند. در کنار شناسایی پروتئین، شناسایی پروتئین‌ها با فراوانی کم می‌توانند برای مطالعه‌ی اصلاحات پساترجمه و کاهش نیاز به فرآیند‌های پیچیده‌ی غنی‌سازی مفید باشند. در آخر، احتمال انجام تحلیل پروتئومیک تک سلول، پژوهش‌های پروتئومیک هیجان‌انگیز را ممکن می‌سازد و به دانشمندان اجازه می‌دهد تغییرات بیان پروتئین هر سلول را تحت محرک‌های خاص مطالعه کنند.

 

منبع

R. Laura, C. Joo, C. Dekker, “Paving the Way to Single-Molecule Protein Sequencing.”, Nature Nanotechnology, 13 (9), 2018.