1
ستاد ویژه توسعه فناوری نانو Iran Nanotechnology Innovation Council بستن
  • ستاد ویژه توسعه فناوری نانو

  • بانک اطلاعات شاخص های فناوری نانو

  • سایت جشنواره فناوری نانو

  • سیستم جامع آموزش فناوری نانو

  • شبکه آزمایشگاهی فناوری نانو

  • موسسه خدمات فناوری تا بازار

  • کمیته استانداردسازی فناوری نانو

  • پایگاه اشتغال فناوری نانو

  • کمیته نانو فناوری وزارت بهداشت

  • جشنواره برترین ها

  • مجمع بین المللی اقتصاد نانو

  • اکو نانو

  • پایگاه اطلاع رسانی محصولات فناوری نانو ایران

  • شبکه ایمنی نانو

  • همایش ایمنی در نانو

  • گالری چند رسانه ای نانو

  • تجهیزات فناوری نانو

  • صنعت و بازار

  • باشگاه نانو

راه را برای توالی یابی تک مولکول پروتئین هموار می کنیم (خلاصه)

افراد مقاله : ‌ مترجم - زهرا اکرمی , مترجم - صادق قربان زاده

موضوع : آموزش و ترویج - علم و پژوهش کلمات کلیدی : توالی‌یابی مولکولی - پروتئین - نانوحفره‌ تاریخ مقاله : 1398/06/05 تعداد بازدید : 109

پروتئین‌ها در تمام سلول‌های زنده عهده دار نقش‌های عملکردی سلول هستند. هزاران نوع پروتئین مختلف عملکردهای سلول از همانند سازی DNA تا پیام‌رسانی و از تسریع متابولیسم تا تولید حرکت سلولی را انجام می‌دهند. بنابراین تحلیل ساختار و عملکرد پروتئین اطلاعات مهمی به منظور درک فرآیندهای بیولوژیکی و شناخت بیماری‌ها در اختیار ما می گذارد. در مقایسه با پیشرفت‌های فنی چشمگیر در حوزه‌ی توالی DNA، توسعه‌ی تکنیک‌های بسیار حساس و پربازده، توالی یابی پروتئین به‌طور جدی عقب مانده است. تنها روش‌های مورد استفاده‌ی فعلی برای توالی پروتئین تخریب گام به گام ادمن، طیف‌سنجی جرمی یا ترکیب این دو روش است.

استاندارد طلایی فعلی برای توالی یابی پروتئین طیف‌سنجی جرمی است. این روش ایرادهایی اساسی از لحاظ محدودیت شناسایی و دامنه‌ی دینامیک دارد. نمونه‌های انسانی بسیار پیچیده و شامل دامنه‌ی گسترده‌ای از تنوع پروتئینی هستند. در پلاسمای انسان، برای مثال، تراکم پروتئین می‌تواند از چند پیکوگرم در میلی‌لیتر (اینترلوکین) تا چند میلی‌گرم در میلی‌لیتر (آلبومین) متفاوت باشد. بنابراین، دامنه‌ی دینامیکی بسیار بالا (109~) برای آنالیز مقایسه‌ای پروتئوم ضروری است. به‌روزترین طیف‌سنجی‌های جرمی محدود به دامنه‌ی دینامیکی 104~ تا 105 هستند. ایراد دیگر این ابزار محدودیت شناسایی آن است، که مانع کشف بیومارکرها می‌شود و نیاز به مقدار زیادی از نمونه‌ دارد. اگر پروتئینی را در نظر بگیریم که در سلولی با تعداد رونوشت کم باشد (کمتر از 1000 مولکول در هر سلول)، بایستی میلیون‌ها سلول به کار گرفته شوند تا محدودیت شناسایی ابزار را فراهم سازند. به همین دلایل طیف سنجی جرمی به عنوان تکنیکی برای آنالیز تک سلول تا شرایط ایده آل فاصله‌ی قابل توجهی دارد.

پیشرفت‌های چشمگیر در فناوری توالی یابی DNA که حتی یک مولکول DNA می‌تواند توالی یابی شود، برای فناوری‌های نو در زمینه‌ی توالی یابی پروتثین الهام‌بخش بوده است. البته به‌دلیل ماهیت پیچیده‌ی پروتئین‌ها، جستجوی چنین روش توالی یابی مهم است. پروتئین‌ها از 20 آمینو اسید متفاوت ساخته شده‌اند، درحالیکه DNA تنها از چهار باز ساخته شده است. مستقل از روش انتخابی، شناسایی 20 سیگنال متفاوت بسیار چالش‌برانگیز است. علاوه‌براین، نمونه‌های DNA با تراکم آنالیت پایین را می‌توان با استفاده از پلیمراز تقویت کرد، درحالیکه پلتفرم‌های توالی یابی پروتئین از چنین سیستم تکثیری بی‌بهره هستند چراکه هیچ روش تقویتی مانند واکنش زنجیره‌ی پلیمراز برای پروتئین وجود ندارد. روش‌های توالی یابی پروتئین که توالی دقیق هر پروتئین را در سطح تک مولکول می‌خوانند، می‌توانند انقلابی برای مطالعه پروتئومیک‌ به ارمغان آورند و حساسیت کافی برای شناسایی پروتئین‌هایی با فراوانی بسیار کم فراهم کنند. به‌علاوه، چنین روشی در مقایسه با روش‌های فعلی به مطالعات پروتئومیکس تک سلولی قابلیت‌های متنوعی می افزاید.

در چند سال گذشته، چندین رویکرد برای توالی یابی پروتئین در سطح تک مولکول ارائه شده است. این ایده‌های نو ادامه‌ی روش های تخریب گام به گام ادمن و طیف‌سنجی جرمی هستند. روش‌های پیشنهادی (شکل1) بر اساس تکنیک‌های تک مولکولی مانند نانوحفره‌ها، فلوئورسانس و جریان‌های تونلی در نانوگپ‌ها هستند.

 

انگشت نگاری پروتئین با استفاده از فلوئورسانس

تکنیک‌های فلوئورسانس به‌منظور توسعه‌ی دستگاه‌های توالی یابی DNA پربازده حائز اهمیت بوده است. در سیستم‌هایی مانند سیستم‌های ایلومینا، پاسیفیک بیوساینس، و هلیکوس، DNA با استفاده از پایش اتصال نوکلئوتید‌های برچسب‌دار شده با فلوئورسانس، طی فرآیند تکثیر، رشته توالی می‌یابد. روش‌های نوپدید توسعه‌ی توالی یابی پروتئین برپایه‌ی فلوئورسانس با چالش‌های زیادی روبه‌رو است. از جمله این محدودیت‌های عمده‌ می‌توان به کمبود فلوئورفور آلی برای شناسایی 20 آمینو اسید متفاوت بدون نویز قابل‌توجه، و عدم حضور شرایط شیمیایی مناسب برای برچسب‌گذاری 20 آمینو اسید اشاره کرد. اخیرا، طرح‌های ساده شده، که در آن تنها یک زیرمجموعه‌ی کوچک از آمینو اسیدها که با استفاده از فلوئورسنت برچسب‌گذاری و شناسایی شده پیشنهاد شده است. این روش‌ها، درصورت اثبات، می‌توانند منجر به توسعه‌ی روش‌های شناسایی پروتئین با حساسیت تک مولکول شوند. این رویکردها به نقشه‌برداری نوری DNA شباهت دارند، که برای شناسایی ویژگی‌های معین ژنوم یا شناسایی پاتوژن‌های مختلف، اطلاعات بخشی از توالی کافی است.

در سال 2015، جو و همکارانش طرح انگشت‌نگاری مبتنی بر شناسایی دو نوع آمینواسید را پیشنهاد دادند. در رویکرد آن‌ها، آمینواسیدهای سیستئین (C) و لیزین (K) پروتئین برچسب گذاری شده و متعاقبا شناسایی می‌شوند. سپس می‌توان از توالی سیستئین‌ها و لیزین‌ها (توالی CK) برای شناسایی پروتئین موردنظر با استفاده از پایگاه‌ داده‌ی پروتئین استفاده کرد. امکان سنجی رویکرد انگشت‌نگاری CK، به‌صورت محاسباتی و با استفاده از پایگاه‌ داده‌ی پروتئین انسانی که شامل تقریبا 20000 مدخل پروتئین بود، مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج بدست آمده نشان داد که با استفاده از این روش می‌توان درصد عمده‌ی (بیش از 70-80 %)  پروتئین‌ها را حتی با احتساب نرخ خطا (20-30 %) به‌طور دقیق تشخیص داد.

مارکوت و همکارانش روش متفاوتی در پیش گرفتند که در آن انگشت‌نگاری پپتید با استفاده از ورژن تک مولکولی تخریب گام به گام ادمن صورت می‌گیرد. برخلاف تخریب گام به گام سنتی ادمن، شناسایی تک مولکول، تحلیل جمعیت‌های مخلوط را ممکن می‌سازد. در این رویکرد، پروتئین‌ها به تکه‌های پپتیدی خرد می‌شوند (به بلندی حدودا 10-30 آمینو اسید) و آمینو اسیدهای خاص با فلوئورفورهایی با رنگ‌های قابل تشخیص برچسب‌گذاری می‌شوند. شبیه‌سازی کامپیوتری به‌منظور بررسی احتمال پیداکردن پروتئین از شناسایی یک توالی پپتید منحصربفرد با استفاده از روش انگشت‌نگاری مارکوت مورد استفاده قرار گرفته است. روش‌های تثبیت متفاوت، برچسب‌گذاری و تقسیم ارزیابی شدند، و مشخص شد حداقل چهار آمینواسید برچسب‌گذاری شده‌ی متفاوت برای شناسایی 98% پروتوم انسانی لازم است.

نقشه‌های انگشت‌نگاری که در اینجا پیشنهاد شده، از این حقیقت که پروتئین‌ها را می‌توان با استفاده از اطلاعات توالی ناقص شناسایی کرد، بهره می‌برد. رویکرد پیشنهادی جو و همکارانش پروتئین‌‌های کامل را می‌خواند وبه این ترتیب به برچسب‌گذاری‌های ساده و دو رنگ سوبستراها نیاز دارد. محدودیت اصلی الزام برچسب شناسایی در پایانه‌ی C و N سوبسترا به‌منظور شناسایی واسرشتگی است. به نظر می‌رسد ترسیم نقشه‌های الحاق به‌منظور افزودن چنین برچسبی به تمام پروتئین‌ها در مخلوط یا مهندسی آنزیمی که شناسایی هر پروتئینی که از آماده‌سازی سلولی و دیگر نمونه‌های بیولوژیکی به دست آید را ممکن می‌سازد امکان‌پذیر است. رویکرد مارکوت برای انگشت‌نگاری از رویکردی به‌کل شیمیایی بهره می‌گیرد، که برای اهداف تجاری‌سازی سودمند است. البته شرایط سخت لازم برای واکنش ادمن نیاز به انتخاب دقیق فلوئورفور و مجموعه‌ای تطبیق برای میکروسکوپ سنتی (TIRFM) دارد. یکی از معایب این روش آن است که هر چرخه‌ی تخریب ادمن تقریبا 45 دقیقه طول می‌کشد و باعث می‌شود فرایند توالی بسیار کند شود. رویکرد جایگزین برای تخریب ادمن درحال بررسی است، در این رویکرد آنزیمی طراحی می‌شود که می‌تواند آمینواسیدها را، دانه دانه، از پایانه‌ی N پروتئین جدا کند. استفاده از این آنزیم، به نام ادمناز[1]، به تخریب ادمن اجازه می‌دهد تا تحت شرایط فیزیولوژیکی و با سرعت بیشتری ادامه یابد.

انگشت‌نگاری فلوئورسانس نقش مهمی در پیشرفت تکنولوژی‌های سریع برای شناسایی و آنالیز موازی پروتئین ایفا می‌کند. میلیون‌ها و هزاران میلیون تک مولکول را می‌توان همزمان تثبیت و پایش کرد که این امر دری به سوی آزمایشات پربازده باز می‌کند. شناسایی تک مولکول پروتئین با استفاده از فلوئورسانس می‌تواند مکمل روش‌های نوپدید توالی یابی پروتئین باشد، و حساسیت روش‌های فعلی شناسایی مواد حجیم از جمله شناسایی پروتئین میکروآرایه آنتی‌بادی یا طیف‌سنجی جرمی مبتنی بر انگشت‌نگاری پروتئین را بهبود بخشد. حساسیت بهبود یافته‌ی این روش‌ها برای کاربردهایی از جمله شناسایی بیومارکرها برای تشخیص بیماری حایز اهمیت است.

 

توالی پروتئین با استفاده از جریان‌های تونلی

ایده‌ی استفاده از جریان‌های تونلی برای سنجش تک مولکول‌ها برای اولین‌بار در سال 1970 مطرح شد. جریان‌های تونلی میان دو الکترود فلزی که با استفاده از شکافی، در محدوده‌ی چند آنگستروم تا چند نانومتر از هم جداشده‌اند، سنجیده می‌شوند. زمانیکه یک مولکول از شکاف نانومقیاس عبور می‌کند، تغییر جریان تونلی اندازه‌گیری می‌شود. این مدولاسیون جریان برای تعیین اینکه کدام مولکول در لحظه و بلادرنگ در شکاف حضور دارد مورد استفاده قرار می‌گیرد.

در سال 2014، لیندسِی و همکارانش اولین سنجش آمینواسیدها و پپتید‌های کوتاه با استفاده از جریان‌های تونلی را گزارش کردند. با استفاده از نقشه‌ای دوبعدی از دامنه‌ی جریان و شکل پیک‌ها، آمینو اسیدهای آنالیز شده در هر دسته با دقت 80% یا بالاتر مشخص می شدند. کاوای و همکارانش نیز پس از آن پژوهشی انجام دادند که تمامی 20 آمینو اسید و فسفوتایروزین‌ها را با استفاده از جریان‌های تونلی تحت شرایط متفاوت آزمایشگاهی آزمایش کردند.

رویکرد شناسایی تونلی که لیندسی و همکارانش استفاده کردند، حساسیت قابل توجهی مبتنی بر جریان تونل‌زنی کوانتومی از خود نشان داد. این روش می‌تواند ایزومرها و مولکول‌ها با تفاوت ساختاری جزئی را که با دیگر روش‌ها مانند طیف‌سنجی جرمی غیر قابل تشخیص‌اند، از یک دیگر تمایز دهد. از معایب این روش می‌توان به پیچیدگی قابل ملاحظه‌ی داده‌ها اشاره کرد. هر مولکول می‌تواند در نقطه‌ی اتصال جهت‌های متفاوتی بگیرد و تغییرات ترجمه‌ای و دورانی مهمی از خود نشان دهد که به سیگنال‌های جریان متفاوتی می‌انجامد. بنابراین با توجه به ترکیب‌های چندگانه که ممکن است مشاهده شود،  الگوریتم‌های یادگیری ماشین برای تشخیص هر مولکول الزامی است.

پژوهش کاوای و همکارانش مشخصه‌یابی سیستماتیکی از آمینو اسید‌ها و پپتیدهای کوتاه متفاوت نشان می‌دهد. از 20 آمینو اسید بررسی شده، 7 آمینو اسید سیگنال‌های قابل تشخیص تولید کردند. این امر نشان‌ دهنده‌ی گام امیدبخشی به سمت تشخیص تفاوت آمینو اسید برای توالی‌یابی پروتئین است. آرایه‌هایی که شامل نقاط اتصال با اندازه‌های متفاوتند، ممکن است تعداد آمینو اسیدهای قابل شناسایی را افزایش دهد و احتمال تشخیص آمینو اسیدها در مخلوط را بالا ببرد. بهبودهای فنی در آزمایش‌های تجربی و فرآیندهای خاص این کار را آسان می‌کند. برای مثال، اخیرا نشان داده شده که پوشش بیشتر روی نانوالکترودها باعث بهبودهایی در نسبت سینگال به نویز و پهنای باند اندازه‌گیری‌ها می‌شود.

برای تبدیل این مفهوم به ابزار توالی یابی، اندازه‌گیری جریان‌های تونلی بایستی با مکانیسم‌هایی ترکیب شود که پلی‌پپتیدها را به‌صورت آمینو اسید به آمینو اسید و کنترل شده در جایگاه تولید سیگنال (شکاف) قرار دهد که چندین گروه اولین تلاش‌های آزمایشگاهی خود در این زمینه را گزارش کرده‌اند.

 

توالی پروتئین با استفاده از نانوحفره‌ها

در سال 2014، سازمان فناوری‌های مبتنی بر نانوحفره‌های آکسفورد خبر تولید اولین دستگاه توالی یابی DNA تک مولکول مبتنی بر نانوحفره‌ها را اعلام کرد. این دستگاه‌های جیبی با امکان خواندن بسیار طولانی و در شناسایی آزمایشگاهی انقلابی در توالی‌یابی DNA به ارمغان آوردند. در آزمایش نانوحفره، غشاء عایق شامل حفره‌ای نانومتری میان دو قسمت پر شده با الکترولیت است. وقتی ولتاژی در غشاء اعمال می‌شود، جریان یونی درون نانوحفره جریان می‌یابد. همانطور که مولکول‌ها تک تک به حفره منتقل می‌شوند، مدولاسیونی در جریان‌های یونی مشاهده می‌شود که اطلاعات ساختاری درباره‌ی مولکول مورد نظر ارائه می‌دهد. با استفاده از این اصل، بیوپلیمرها چنان توالی می‌یابند که هر قسمت از زنجیره در انقباض نانوحفره به‌صورت عرضی توالی ‌یابد. پتانسیل نانوحفره‌ها برای توالی DNA اثبات شده است. استفاده از نانوحفره‌ها برالی توالی تک مولکول پروتئین‌ها مرز بعدی است. این کار به هیچ وجه ساده نیست، چراکه برای توالی یابی پروتئین با استفاده از نانوحفره‌ها بایستی از پس چالش‌های بزرگی بربیاییم. اول اینکه، برخلاف DNA که ضرورتاً توزیع بار یکنواختی دارد، ساختار آمینو اسیدها توزیع بار بسیار متنوعی دارد. بنابراین انتقال تک‌جهت پلی‌پپتیدها به‌وسیله‌ی اعمال الکتروفورز در نانوحفره‌ها به آسانی قابل اجرا نیست. دوم، بیشتر پروتئین‌ها در حالت پایه‌شان پیچ خورده اند. اختلال در ساختار دوم و سوم آن‌ها برای عبور از نانوحفره ضروری است. سوم، توالی پروتئین نیازمند تمایز 20 آمینو اسید متفاوت، با اندازه‌ای پنج برابر بزرگتر از توالی DNA با چهار باز است. برای اولین انتقال در نانوحفره از پلی‌پپتیدهایی استفاده شد که تنها 20 تا 30 آمینو اسید داشتند. پپتیدهای کوتاه ساختار سوم ندارند و بدون نیاز به عوامل تغییر ساختار، قابل انتقال هستند. درحالیکه انتقال پپتیدها هنوز هم مدل ارزشمندی برای فهمیدن گام‌های پایه‌ای فرآیند پیچیده‌ی انتقال پروتئین است، هدف نهایی توالی‌یاب پروتئین مبتنی بر نانوحفره، خواندن تمام پروتئین‌ها است و به تغییر ماهیت پروتئین نیاز دارد.

یکی دیگر از موانع اصلی توسعه‌ی توالی‌یاب پروتئین با استفاده از نانوحفره، توزیع بار غیر یکنواخت ساختارهای آمینو اسیدی است. برخلاف DNA که توزیع بار یکنواختی دارد و با نیروی الکتروفورز در نانوحفره حرکت می‌کند، پروتئین‌ها بار محلی متفاوتی حمل می‌کنند. به‌علاوه مشخص نیست که نیروهای الکتروفورز و الکترواسمز از پس انتقال پروتئین بربیایند.  در تمام مطالعاتی که تاکنون انجام شده، انتقال پروتئین‌ها در مقیاس زمانی سریع‌تر از یک میلی ثانیه اتفاق می‌افتد که برای هدف توالی ‌یابی بسیار سریع است. در واقع، انتقال تک پروتئین ماهیتا بسیار سریع اتفاق می‌افتد. کنترل سرعت انتقال به‌منظور تضمین زمان کافی برای خواندن دقیق آمینو اسیدهای متفاوت به‌وسیله‌ی نانوحفره امری ضروری است.

به‌طور خلاصه، با استفاده از رویکرد نانوحفره در زمینه‌ی توالی یابی پپتیدها و پروتئین‌ها پیشرفت‌های بزرگی حاصل شده است. این شاخه‌ بسیار فعالانه مورد مطالعه قرار گرفته و به همین دلیل پیشرفت‌های مهمی در جهت توسعه‌ی توالی یاب پروتئین در سال‌های آتی پیش بینی می‌شود. یکی از مزایای نانوحفره در این زمینه امکان خواندن طولانی است. روش‌های سنتی توالی یابی از جمله تخریب ادمن و طیف‌سنجی جرمی بر پایه‌ی تقسیم پروتئین‌ها به پپتیدهای کوتاه است، اما دستگاه‌های نانوحفره توالی یابی پروتئین کامل را ممکن می‌سازد. چالش اصلی کنترل سرعت انتقال پلی‌پپتیدها است. در حال حاضر رویکردهای متفاوتی در دست بررسی است و احتمال می‌رود مانند مورد توالی یابی DNA، انتقال‌هایی به کمک آنزیم این گام را جلو ببرند.

 

چشم انداز

پروژه‌ی ژنوم انسان سال‌های هیجان انگیز مطالعات ژنومی را آغاز کرد. در سالهای پیشِ رو شاهد پیشرفت‌ مهمی در دیگر ئومیک‌ها[2]، به ویژه پروتئومیک خواهیم بود. در این حوزه، توسعه‌ی رویکردهای تک مولکولی کلید دست یافتن به حساسیت و گستره‌ی دینامیک مورد نیاز برای تحلیل پروتئین‌ها است. تلاش‌ها در شاخه‌های فلوئورسانس تک مولکول، جریان‌های تونلی و نانوحفره‌ها ادامه دارد. در این مجال، ما رویکردهای کلیدی که تاکنون برای توالی یابی تک مولکول پروتئین پیشنهاد شده‌اند را همراه با نقاط قوت و محدودیت‌هایشان ارائه کردیم. در جدول1 خلاصه‌ای از طرح‌های متفاوت ارائه شده، همراه با در نظر گرفتن معیارهای مرتبط برای توسعه‌ی توالی یاب پروتئین، از جمله مدت زمان خواندن و احتمال اجرای توالی یابی جدید را ارائه کردیم.

تحقق رویای توالی یاب تک مولکول پروتئین از نظر فنی بسیار چالش‌برانگیز است. هرچند، اگر این هدف محقق شود با تسهیل شناسایی پروتئین‌ها با فراوانی کم و دستیابی به پروتئومیک‌های تک سلول واقعی، در پژوهش‌های پروتئومیک، انقلابی برپا می‌شود. پروتئین‌ها با فراوانی کم برای پژوهش‌های زیست پزشکی ضروری هستند چراکه شناسایی بیومارکرهای اختصاصی بیماری را ممکن می‌سازند. علاوه‌براین، حساسیت شناساگر تک مولکول دسترسی به پروتئوم تاریک[3] انسان را امکان‌پذیر می‌کند. پروتئوم تاریک شامل تقریبا 3000 پروتئین انسانی است که برخلاف شواهد مبنی بر وجودشان در ژنتیک و اطلاعات رونویسی، هیچوقت مستقیما شناسایی نشده‌اند. در کنار شناسایی پروتئین، شناسایی پروتئین‌ها با فراوانی کم می‌توانند برای مطالعه‌ی اصلاحات پساترجمه و کاهش نیاز به فرآیند‌های پیچیده‌ی غنی‌سازی مفید باشند. در آخر، احتمال انجام تحلیل پروتئومیک تک سلول، پژوهش‌های پروتئومیک هیجان‌انگیز را ممکن می‌سازد و به دانشمندان اجازه می‌دهد تغییرات بیان پروتئین هر سلول را تحت محرک‌های خاص مطالعه کنند.

 

منبع

Restrepo-Pérez, Laura, Chirlmin Joo, and Cees Dekker. 2018. “Paving the Way to Single-Molecule Protein Sequencing.” Nature Nanotechnology 13 (9). Springer US: 786–96. https://doi.org/10.1038/s41565-018-0236-6.

 

این مقاله به‌صورت خلاصه‌شده در اختیار شما قرار گرفته است، در صورت علاقه‌مندی برای مطالعه متن کامل به سایت مراجعه نمایید.